申请/专利权人：厦门逸漠生物科技有限公司

申请日：2023-11-03

公开（公告）日：2024-01-26

公开（公告）号：CN117448260A

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;C12N5/074

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.02.13#实质审查的生效;2024.01.26#公开

摘要：本发明涉及一种人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官的方法。所述方法包括：人诱导多能干细胞培养、拟胚体的诱导、拟胚体的分化、耳泡形成阶段和内耳类器官成熟。所述方法克服了现有技术的缺点，首先，人诱导多能干细胞可以由人体的血液细胞、皮肤细胞等去分化诱导而来，解决了细胞来源的问题；另外，由于多能干细胞的全能性，由多能干细胞分化来的内耳类器官含有多种细胞成分，包括能传递声音、重力和头部运动信号的机械敏感毛细胞，再加上由多能干细胞生成类器官的方案中可以对干细胞进行基因编辑和标记，并可以大批量、标准化进行分化，因此具有广阔的应用前景。

主权项：1.一种人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：Ⅰ人诱导多能干细胞培养：S1、将人诱导多能干细胞用ncTarget培养基培养在Matrigel包被的培养板上，培养板放置在细胞培养箱中进行培养，待细胞密度达到75％-85％时，用EDTA消化成小的细胞团块；S2、将步骤1培养的人诱导多能干细胞用ncTarget培养基传代接种在新的Matrigel包被的培养板上，继续在细胞培养箱中进行培养，24小时后更换培养基继续培养；II拟胚体的诱导-分化第-2-7天：S1、传代培养48小时后，细胞长到70-90％的密度，弃去旧的ncTarget培养基，用预温的PBS洗一次后加入1ml孔的TrypLETMExpress置于培养箱消化5min后迅速吸弃；加入1ml孔DMEMF12混匀细胞，将细胞悬液移入空的离心管中，随后缓慢加入9mlDMEMF12，20μlY27632，200g离心5min，离心后吸弃上清，用5mlncTarget重悬，以每孔100μl接种至超低吸附圆底96孔板，封好封口膜；820rpm离心3min，揭去封口膜，于细胞培养箱中继续培养24小时；S2、24小时后，进入分化第-1天，每孔加入100μlncTarget，达到每孔200μl，将培养板放置在细胞培养箱中继续培养24小时；S3、24小时后，进入分化第0-3天，吸弃培养基，加入100μl孔分化CDM培养基，在细胞培养箱中培养4天；S4、分化第4-7天：将32.5μl的50μgmlFGF2和1.3μl5mM的LDN-193189加入到1.267ml步骤S3培养后的CDM培养基中，放置在细胞培养箱中孵育4天；Ⅲ拟胚体分化-分化第8-11天：将15.6μl的5mMCHIR-99021CHIR加入到1.285ml步骤S4培养后的CDM中，放置在细胞培养箱中培养4天；Ⅳ耳泡形成阶段-分化第12-18天：在第11天准备20ml类器官成熟培养基OMM，储存在4℃，或者，在第12天准备20ml类器官成熟培养基OMM，使用前需在冰上冷藏至少30min；并在第11天从-20℃取出基质胶到4℃过夜解冻；将100μl的解冻过的基质胶移至10ml的冷OMM中，反复将冷OMM移至基质胶管中；待基质胶完全转移到OMM后，反复吹打溶解基质胶；在10ml的OMM+基质胶中加入20μl5mMCHIR，混合均匀，加热到RT；将产生的聚集体转移到1个常规100mm培养皿，然后再将聚集体转移到1个2mlEP管中；用1-2ml的DPBS洗涤聚集体2次，用1ml的OMM+基质胶+CHIR洗涤1次；将1ml的OMM+基质胶+CHIR加入到EP管中，将聚集体转移到1个新的常规100mm培养皿，并补充至10ml；将100mm的培养皿放入细胞培养箱中，孵育3天后，加入10mlOMM+20μl5mMCHIR；分化第15天，使用前加热OMM至RT或37℃，加入10mlOMM+20μl5mMCHIR；将培养皿放回细胞培养箱中，继续孵育3天；Ⅴ内耳类器官成熟阶段-分化第19天至成熟：将培养皿中的聚集体转移到新的常规100mm培养皿中，并加入10mlOMM，把培养皿放回细胞培养箱培养至成熟。

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