申请/专利权人：四川大学

申请日：2022-12-22

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN116036231B

主分类号：A61K38/08

分类号：A61K38/08;C12N15/70;C07K7/06;C07K7/08;C07K1/22;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/36;A61P31/04;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2023.05.19#实质审查的生效;2023.05.02#公开

摘要：本发明提供了一种抗菌肽在制备抗菌剂中的用途，所述抗菌肽包括序列为RCASSCGAK、RCASSCGAKS、TGMRCASSCGAK、TGMRCASSCGAKS的多肽中的任意一种或多种，且所述多肽序列包括如下修饰：半胱氨酸被修饰为恶唑酮‑硫代酰胺基团；其中序列为RCASSCGAK多肽的含量高于60％。本发明抗菌肽具有优异的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等多种细菌具有抑菌效果，特别是对于多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌活性优异，在抗菌抗感染药物、防腐剂等领域具有很好的应用前景。

主权项：1.一种抗菌肽在制备抗菌剂中的用途，其特征在于，所述抗菌肽是包括如下多肽的混合物：（a）序列为SEQIDNO.1所示的多肽；（b）序列为SEQIDNO.2所示的多肽；（c）序列为SEQIDNO.3所示的多肽；（d）序列为SEQIDNO.4所示的多肽；且所述多肽序列中包括如下修饰：半胱氨酸被修饰为恶唑酮-硫代酰胺基团；其中，序列为SEQIDNO.1所示的多肽占总肽段数的60%以上；所述抗菌肽由如下方法制备得到：（1）制备含有RrmbnA基因、RrmbnB基因和RrmbnC基因的重组菌；所述RrmbnA基因序列如SEQIDNO.5所示；RrmbnB基因序列如SEQIDNO.6所示；RrmbnC基因序列如SEQIDNO.7所示；（2）诱导培养步骤（1）所述的重组菌，得到含抗菌肽的菌液；所述重组菌为重组大肠杆菌BL21DE3；（3）纯化步骤（2）的菌液，即得；步骤（1）所述重组菌的制备方法如下：1）分别构建含有RrmbnA基因序列的重组质粒A，以及含有RrmbnB基因序列和RrmbnC基因序列的核苷酸片段的重组质粒B；所述重组质粒A由载体pET28b通过XbaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化，与片段P4进行同源重组构建而成，P4的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；所述重组质粒B由RrmbnB基因序列和带有6×His标签的RrmbnC基因序列构建至pETDuet-1载体形成；2）将步骤1）制备得到的重组质粒A和B共转化至表达菌BL21DE3的感受态细胞，得到阳性克隆即可；步骤（2）诱导培养的方法为：取重组菌至所得阳性克隆至100mLLB液体培养基，于摇床37℃、220rpm培养3h；按照1：50的体积比转接至15个1L的LB培养基中，于摇床37℃、220rpm培养至OD600为0.6，将摇床降温至16℃、降速至180rpm，继续培养30min；每1L培养物中添加终浓度为100mM的诱导剂IPTG，继续培养16h；步骤（3）所述纯化的方法为：1’）粗分离：菌液过镍柱亲和层析柱，洗脱得到复合物；所述方法是将菌液经3800rpm离心12min，弃上清，用含10mMpH8.0的Hepes的缓冲液重悬菌体沉淀；加入终浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF，经高压细胞破碎仪破碎菌体；高速冷冻离心机15000rpm离心30min分离上清和沉淀；取上清液过镍柱亲和层析柱，洗脱酶与抗菌肽的复合物；2’）超滤分离：将步骤1’）得到的复合物于超滤管离心，收集超滤管滤液；所述方法为将复合物置于10kDa超滤管中离心，3800rpm，30min，收集超滤管滤液；3’）缓冲液置换：将步骤2’）得到的滤液经大孔吸附树脂HP-20纯化，用超纯水冲洗除去缓冲液成分，最终用200mL60%乙腈洗脱目标成分，冷冻干燥过夜；4’）分子筛再纯化：重悬步骤3’）得到的冻干粉，经Superdex7510300GL凝胶层析柱进行分离，收集洗脱峰，冻干即得纯化后的抗菌肽；所述抗菌剂是抗鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌中的任意一种或多种的药物。

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百度查询： 四川大学 一种抗菌肽的用途

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