申请/专利权人：河南省肿瘤医院

申请日：2022-01-22

公开（公告）日：2024-03-29

公开（公告）号：CN114410791B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12N15/11;G16B25/20;G16B40/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.29#授权;2022.05.20#实质审查的生效;2022.04.29#公开

摘要：本发明公开了一种基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的检测方法，该方法包括：1、基因融合信息收集和管家基因确定；2、探针设计；3、建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定；它收集了目前肺癌靶向治疗相关的大部分融合类型，并确定了每个基因融合断点处的上下游序列，以及基于element方法设计探针。与其他基于NanoString平台检测的肺癌相关融合更加全面，尤其是在MET和NTRK123这四个基因的融合方面；通过检测ROS1基因5’和3’端是否不平衡的方式检测是否发生融合一直是一个难题，检测灵敏度很低且阈值很难判定，我们重新优化了算法并确定了新的阳性判断标准。

主权项：1.一种基于NanoString平台的探针在制备用于检测肺癌基因融合产品中的应用，其中具体步骤如下：1基因融合信息收集和管家基因确定以NCCN非小细胞肺癌诊疗指南2020.v2版推荐检测的融合为基本指导，确定收集ALK、RET、MET、ROS1和NTRK123的融合信息；在COSMIC数据库中通过检索这七个基因在肺癌中的融合，再收集它们在5’端和3’端的具体断点信息，最后根据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序列，确定ALK、RET和ROS1的常见断点处，并获取上游和下游序列；选择在肺癌中具有不同表达量的四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A和GUSB用作质控和标准化；2探针设计依据每个融合亚型断点处的上下游序列分别设计探针A、探针B和保护探针，并在ALK、RET、ROS1常见断点处的上游和下游分别设计四段探针：5p-1、5p-2、5p-3、5p-4和3p-1、3p-2、3p-3、3p-4，包括探针A和探针B，在四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A和GUSB的保守区设计探针，包括探针A和探针B；3建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定，其具体步骤如下：1收集经RNA-basedNGS验证为ALK、RET、ROS1、MET和NTRK123融合阳性和阴性的肺腺癌患者样本，进行NanoString实验，具体操作步骤如下：a利用QiagenRNA提取试剂盒提取总RNA，并利用Nanodrop2000测定样本浓度和Agilent2100生物分析仪测定DV200；b样本的总投入量限定在30-150ng，DV200≥30％，将样本、探针包括捕获探针、报告探针和保护探针、杂交缓冲液以及TagSet混匀杂交并将杂交混合物置于67℃的PCR仪器上杂交16h-24h；杂交充分以后，用RNase-freeH2O稀释到30～35ul，将稀释后的杂交物用移液器转移到NanoString专用的卡夹中，按照仪器操作提示将卡夹置于nCounterSPRINT中；c将样本信息添加至nCounterSPRINTTMProfilerControlCenter系统，点击“Start”即可开始运行；d系统运行结束后，将生成的RCC文件导出；2将RCC文件导入nSolverv4.0版软件中，首先利用四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A、GUSB和六个阳性质控品的counts数来判断质控是否合格；再利用四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A和GUSB将counts数进行标准化处理，将标准化之后的信息导出到excel表格中；3建立阳性阈值计算模型a质控标准：样本中GAPDH基因的原始数据counts数＞600；bALK和RET的5’和3’端不平衡阳性阈值计算：利用标准化后的数据先计算每个样本ALK和RET基因3’端的四个探针3p-1、3p-2、3p-3和3p-4的几何平均数，定义为E3，再计算每个样本5’端的四个探针：5p-1、5p-2、5p-3和5p-4的中位数，定义为A5；ALK和RET基因的背景值定义为B5；取每个样本中E3A5B5的最小值，以RNA-basedNGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算ALK融合阳性阈值为3，RET融合阳性阈值为5；cROS1基因5’和3’端不平衡计算：利用标准化后的数据我们先计算每个样本ROS1基因3’端的四个探针3p-1、3p-2、3p-3和3p-4的几何平均数，定义为E3，若E3＞700，可以作为ROS1阳性的初步筛选条件，若E3＜700，即可排除阳性结果；计算E3＞700样本中ROS1基因5’端的四个探针5p-1、5p-2、5p-3和5p-4的中位数，定义为A5；ROS1基因的背景值定义为B5；取每个样本中E3A5B5的最大值，以RNA-basedNGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算ROS1融合阳性阈值为1.852；dMET野生型探针的质控：利用标准化后的数据求得一个批次中阴性质控品counts数的mean±2SD，若MET野生型探针MET-MET_E13：E14和MET-MET_E14：E15的counts数大于mean±2SD，则认为质控合格，可以正常判断MET-MET_E13：E15；e融合探针阳性阈值计算：将标准化后的counts数除以每批次样本中各自融合探针counts数的中位数，得到的数值用来评估融合探针是否阳性；求得每个样本中该数值的最大值作为ROC曲线的值，以RNA-basedNGS结果为标准分为阳性组和阴性组，并利用ROC曲线计算阳性阈值为5；f阳性结果判定：若ALK、RET和ROS1基因检测到5’和3’端不平衡，即可判定为阳性，其中若同时检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，即可判定为某种融合阳性，若未检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，可判定为某种基因的未知融合类型阳性；若仅检测到ROS1融合探针阳性但未检测到ROS1基因的5’和3’端不平衡，亦可判定为ROS1某种融合阳性；若ALK和RET基因未检测到5’和3’端不平衡，但检测到ALK和RET的融合探针阳性，认为可能检测到的融合为假阳性，判定为阴性结果；若MET、NTRK123检测到融合探针阳性即可判定为阳性；其中，探针序列如下：

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