申请/专利权人：西北农林科技大学

申请日：2020-09-30

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN112226408B

主分类号：C12N5/0784

分类号：C12N5/0784;C12N5/071;C12N5/0786;G01N27/62;G01N33/569;C07K14/08;A61K39/12;A61P31/14

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2021.02.02#实质审查的生效;2021.01.15#公开

摘要：本发明通过对免疫原（病原或蛋白抗原）上的有效抗原肽序列进行筛选，去除免疫原中对机体不具有免疫活性（即不能激活机体适应性免疫应答）的无用肽段，筛选出免疫活性较强，可高效刺激机体产生免疫应答的抗原肽。抗原肽相对于原始免疫原，因其序列较短，亲水性较强，因此易于在体外进行表达，并且可随意将不同抗原肽或不同免疫原来源的抗原肽串联制备复合抗原肽，或将同一抗原肽进行多次重复以增强T细胞识别，同时可与其他具有免疫增强蛋白等融合表达，进一步增强机体免疫系统对抗原肽所产生的免疫应答反应。

主权项：1.一种利用猪源APCs在猪种属上对病原或外源性蛋白进行特异性抗原肽筛选鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，猪源APCs细胞的制备；步骤二，抗原肽的质谱鉴定；步骤三，基于NanoLuc融合蛋白的抗原肽的ELISA验证；所述步骤一，猪源APCs细胞的制备采用如下方法：（1）猪骨髓源树突状细胞，通过分离仔猪的长腿骨，开孔后使用细胞培养液冲洗骨髓腔，获得的骨髓细胞经过猪粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子GM-CSF的诱导后经体外培养7天后获得；（2）猪肺泡巨噬细胞，通过冲洗猪肺脏后，将肺泡灌洗液离心后获得；（3）猪外周血单核细胞源巨噬细胞，收集猪抗凝血，通过使用淋巴细胞分离液，从抗凝血中获得猪外周血单核细胞，加入猪粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子GM-CSF和猪白介素4体外诱导培养7天后获得；或者（4）使用外来免疫原免疫猪个体，其后，分离猪的脾脏，淋巴结，经过体外在单细胞滤网上研磨获得包含有猪内源性巨噬细胞的免疫细胞群；所述步骤二，抗原肽的质谱鉴定的方法包括如下步骤：（1）制备富集“SLA-DR-抗原肽”复合物；（2）获得抗原肽氨基酸序列；（3）使用质谱仪测定抗原肽的分子量，并通过质谱分析软件搜索病原来源蛋白氨基酸数据库的方式以确定抗原肽氨基酸序列；所述制备富集“SLA-DR-抗原肽”复合物的方法为：使用APCs经过免疫原刺激，再使用细胞裂解缓冲液裂解APCs制备细胞裂解液，使用识别SLA-DR的抗体从全细胞裂解液中富集“SLA-DR-抗原肽”复合物；所述获得抗原肽氨基酸片段的方法为：将富集“SLA-DR-抗原肽”复合物使用三氟乙酸缓冲液处理，从SLA-DR上分离洗脱抗原肽，再使用截留分子量为5kD的超滤管，去除残留抗体及SLA-DR分子单体，使滤过液中仅含有抗原肽，再通过脱盐处理后，即得到所述抗原肽氨基酸片段；所述步骤三，基于NanoLuc融合蛋白的抗原肽的ELISA验证的方法包括如下步骤：（1）将所获的抗原肽依照其cDNA序列人工合成克隆进入pET28-NanoLucC1载体，表达为NanoLuc融合抗原肽，并使用NanoLuc抗体检测融合；（2）分别将NanoLuc融合抗原肽作为包板抗原，通过ELISA检测相应病原感染猪血清样本，ELISA检测为阳性的肽段即为有效的抗原肽，否则不是有效的抗原肽。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 西北农林科技大学 一种猪病原或外源性蛋白特异性抗原肽筛选和鉴定的方法

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