申请/专利权人：西北农林科技大学

申请日：2020-08-13

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN111893119B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/89;A61D19/04;A01K67/027

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2020.11.24#实质审查的生效;2020.11.06#公开

摘要：本发明公开了一种利用CRISPRCas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法。体外转录获得CRISPRCas9系统，采用两个sgRNA共同打靶同一目的基因的原则进行山羊受精卵显微注射；奶山羊进行同期发情与超数排卵处理后，在母羊最后一次接受交配后的8‑12小时，即发情开始后约46‑50小时进行冲胚，获得原核期受精卵，并置于含有10％胎牛血清的M199培养液中进行显微注射；本发明提高了SCD1基因编辑山羊胚胎的发育率及基因编辑效率，具有良好的推广应用前景和经济价值。

主权项：1.一种利用CRISPRCas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）通过体外转录获得CRISPRCas9系统，该系统包括Cas9mRNA以及用于打靶山羊SCD1基因的两种sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列为：5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’及5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’；2）将所述CRISPRCas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎；所述步骤2）中，对发情母羊最后一次接受交配后8-12小时或发情开始后46-50小时收集的受精卵进行体外显微注射，显微注射针口径不超过1μm，受精卵的液体注入量1-2pL，Cas9mRNA的浓度为50-100ngμL，每个sgRNA的浓度为25-50ngμL；所述显微注射采用的显微注射针利用拉针仪拉制而成，拉制参数设置为：heat=786-846，pull=90-110，velocity=140-160，time=190-210；所述显微注射的注射参数设置为：注射压强pi为150-400hPa，注射时间t为0.1-0.3s，维持压强pc为30-50hPa。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 西北农林科技大学 利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法

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