申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2021-04-19

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN115216460B

主分类号：C12N9/42

分类号：C12N9/42

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.11.08#实质审查的生效;2022.10.21#公开

摘要：本发明公开了一种米黑根毛霉糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶的制备方法及应用。本发明通过将巴斯德毕赤酵母的FLD1基因和酿酒酵母的Sso1基因与目的蛋白质RmXEG12A共表达，构建出产木葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌，提高RmXEG12A的分泌表达水平。RmXEG12A在5L发酵罐中高密度发酵，发酵液的酶活力可达25700UmL。本发明提供的蛋白质RmXEG12A具有良好水解特性，高效水解富含木葡聚糖的罗望子粉和罗望子胶生成不同聚合度的木葡寡糖，将木葡寡糖制备益生元酸奶可增加酸奶的持水力，提升酸奶的品质。因此本发明所得木葡聚糖酶RmXEG12A在食品工业中具有重要的应用潜力和发展前景。

主权项：1.一种生产木葡聚糖酶的方法，包括如下步骤：（A）将来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的编码基因、来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的编码基因、来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的编码基因导入受体毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；（B）按照如下步骤对所述重组毕赤酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得木葡聚糖酶XEG12A：B1）基础发酵培养：将所述重组毕赤酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；B2）甘油补料发酵阶段：在步骤B1）的基础上，将甘油以15-30mLhL起始发酵液的速度流加到发酵体系中，待菌体湿重达180-220gL，停止流加甘油，饥饿0.5-1h左右，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；B3）甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2）的基础上，将甲醇流加到发酵体系中4h内使流速从3.6mLhL起始发酵液增加至10.9mLhL起始发酵液，然后维持10.9mLhL起始发酵液速度流加甲醇至发酵结束；步骤（A）中，所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A为SEQIDNo.1自N末端第21至242位氨基酸残基组成的蛋白质；步骤（A）中，所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的编码基因是通过重组载体1的形式导入所述受体毕赤酵母中的；所述重组载体1为将所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的编码基因插入到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒；步骤（A）中，所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的编码基因是通过重组载体2的形式导入所述受体毕赤酵母中的；所述重组载体2为将所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的编码基因插入到pPICZA载体的多克隆位点后得到的重组质粒；步骤（A）中，所述来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的编码基因是通过重组载体3的形式导入所述受体毕赤酵母中的；所述重组载体3为将所述来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的编码基因插入到pGAPZB载体的多克隆位点后得到的重组质粒；步骤B1）中，还包括加入PTM1溶液的步骤；所述PTM1溶液的加入量为每1L起始发酵液中加入4.35mL所述PTM1溶液；步骤B1）中，所述培养的温度为30℃、pH为4.0、转速为600rpm；步骤B2）中，所述甘油是溶于水中而形成的500gL的甘油水溶液；所述甘油补料发酵阶段的培养温度为30℃、pH为4.0、控制溶氧大于20%；步骤B3）中，所述甲醇是无水甲醇；所述甲醇补料诱导表达阶段的培养温度为30℃、pH为6.0、控制溶氧大于20%，发酵时间6-7天。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国农业大学 一种米黑根毛霉糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶的制备方法及应用

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