申请/专利权人：舟山海关综合技术服务中心

申请日：2022-03-28

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN114720594B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72;G01N30/86

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.07.26#实质审查的生效;2022.07.08#公开

摘要：本发明公开了一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，利用柱前衍生‑UPLC‑MSMS‑内标法测定转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的检测方法；采用UPLC‑MSMS，在电喷雾电离ESI+和多反应监测模式下测定，用同位素内标法进行定量分析，实现对转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸的快速分离和准确定性定量。本方法灵敏度高、回收率好、定性能力强、分辨率高，且前处理过程操作简单，能满足在线自动化检测的要求，从而达到绿色、高效、准确定性定量分析的目的。本方法操作简单、耗时较短、提取率好，更有效降低复杂基质成分的干扰、检出限低，适用于转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的日常检测工作。

主权项：1.一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：1配置标准品：移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液于容量瓶中用纯水定容后得到混合标准储备液，然后利用纯水逐级稀释混合标准储备液，得到浓度逐级变化的混合标准溶液系列；所述的草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液，质量浓度为1000mgL，称取相同质量的草甘膦和氨甲基膦酸后用纯水溶解制备而成的；准确移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用纯水定容至100ml，制备成10mgL的混合标准储备液，于4℃下储存备用；所述的混合标准溶液系列，逐级变化的浓度为1ngml、2ngml、5ngml、10ngml、20ngml、50ngml、100ngml；2样品提取、净化和衍生：将待测的转基因大豆样品均质化处理得到均质，向大豆均质中加入同位素内标溶液，依次使用盐酸-水溶液和草甘膦检测基质方法包提取、二氯甲烷脱脂、超声提取和离心，取上清液过RM净化柱后得到净化液；取所得净化液加入四硼酸钠水溶液和FMOC-Cl乙腈溶液，摇匀，密封，衍生，过有机滤膜得到待测液，待上机检测；所述的均质化处理，操作步骤为：将大豆是置于粉碎机粉碎，过60目筛得到质化后的转基因大豆样品；精准称取2.00g均质化后的转基因大豆样品后加入50μL浓度为1μgmL的同位素内标溶液；所述的同位素内标溶液为同位素1,2-C13N15草甘膦内标溶液；所述的盐酸-水溶液提取，操作步骤为：向体系中加入10ml盐酸-水溶液，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm；所述的盐酸-水溶液为0.1％盐酸溶液；所述的草甘膦检测基质方法包提取，操作步骤为：向体系中加入100mg草甘膦检测基质方法包，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm；所述的基质缓冲包为草甘膦检测基质方法包；所述的二氯甲烷脱脂，操作步骤为：向体系中加入10ml二氯甲烷，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm；所述的超声提取，超声提取的频率为40KHz，超声提取时间为15min；所述的离心，转速为10000rmin、离心时间为5min；所述的RM净化柱，在使用前需用6mL甲醇活化，6mL去离子水平衡；取5mL上清液过RM净化柱，收集后可得2.5mL净化液；所述的四硼酸钠水溶液质量分数为0.5％，FMOC-Cl乙腈溶液浓度为1mgmL，1ml上清液中加入0.2mL四硼酸钠水溶液和0.2mLFMOC-Cl乙腈溶液涡旋混合30s后密封，涡旋转速为2000rpm；进行衍生化反应时，所述的衍生温度为40℃，时间为2h；衍生结束冷却至室温后过有机滤膜；所述的有机滤膜规格为0.22μm；3测定分析混合标准溶液系列：将步骤1中得到的混合标准储备液进行色谱分离、质谱测定分析，得到草甘膦和氨甲基膦酸的保留时间、特征离子和离子碎片质量色谱图；将步骤1中的到的浓度逐级变化的系列混合标准溶液，按步骤2中的衍生法进行衍生后，采用UPLC-MSMS以步骤3的仪器条件进行测定分析，以同位素1,2-C13N15草甘膦作为内标物进行定量，以定量离子与同位素内标峰面积比值为纵坐标Y，质量浓度与内标浓度比值为横坐标X绘制标准工作曲线，单位为ngml；所述的色谱条件为：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18，规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.30mLmin；流动相A为0.1％甲酸乙腈溶液；流动相B为含0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～3.5min时，A相体积分数由10％逐渐增加至30％，3.5～3.7min时，A相体积分数由30％逐渐增加至95％，3.7～10min时，A相体积分数保持在95％，10～10.2min时，A相体积分数由95％逐渐减少至10％，10.2～12.0min，A相体积分数保持在10％，平衡5min；所述的质谱条件为：离子源：电喷雾电离ESI；扫描方式：正离子扫描方式；采集模式：多反应监测模式MRM；毛细管电压：1.0kV；雾化器温度500℃；锥孔气流速：50Lh；雾化气流速：1000Lh；离子源温度：150℃；4定性定量转基因大豆样品中草甘膦和氨甲基膦酸：将步骤2中到的转基因大豆样品的待测液，按照步骤3中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到转基因大豆样品的色谱图和峰面积，与步骤3中的质量色谱图进行匹配分析且带入标准曲线进行计算，通过内标法能够定性、定量分析测定出转基因大豆样品中的草甘膦和氨甲基膦酸。

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