申请/专利权人：浙江工商大学;杭州邦沃森生物科技有限公司

申请日：2018-07-04

公开（公告）日：2018-12-11

公开（公告）号：CN108982644A

主分类号：G01N27/62(2006.01)I

分类号：G01N27/62(2006.01)I;G01N33/487(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.01.28#发明专利申请公布后的驳回;2019.01.04#实质审查的生效;2018.12.11#公开

摘要：本发明公开了基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法,包括以下步骤：A、使用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面，形成气溶胶，将气溶胶引入质谱仪并由质量分析器检测，获得质谱轮廓图南极犬牙鱼脂质质谱轮廓图；B、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、滤噪、中心化和质量校准处理，将质谱数据与脂质分子数据库比对确定南极犬牙鱼的脂质组学轮廓。本发明检测速度快、灵敏度和分辨率高、结果稳定，为脂质组学研究和鱼类生物信息检测提供了新的检测手段。本发明可满足快速、高通量、实时检测的需求。

主权项：1.基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法,其特征在于，包括以下步骤：A、使用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面，形成气溶胶，所述气溶胶经Venturi泵氮气驱动，采用正交方式经PTFE管引入质谱端口后与1.1Ω、3V、500℃的Kanthal A1灯丝碰撞，随后气溶胶中的脂质离子进入质谱仪的StepWave装置并由质量分析器检测，以丙二醇亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂，经针泵注射进样器以0.1mLmin的流量引入端口；质谱仪扫描时间为1秒，扫描范围为mz 100‑1200；以负电离模式收集数据，获得南极犬牙鱼脂质质谱轮廓图；B、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、滤噪、中心化和质量校准处理，即质谱数据保存为txt文本格式，根据质谱数据得到相对含量为5％以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，结合相对含量为10％以上的离子二级质谱碎片、Lipid MS Predictor和LipidMap脂质分子数据库比对确定南极犬牙鱼的脂质组学轮廓。

全文数据：基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法技术领域[0001]本发明涉及脂质组学轮廓的检测，特别是一种基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法。背景技术[0002]南极犬牙鱼Dissostichuseleginoides，亦称美露鳕、南极鳕鱼，属福鳍鱼纲、鲈形目、南极鱼科、南极犬牙鱼属，主要分布在南美、澳洲以及次南极区群岛海域，生存水域深及2500米。南极犬牙鱼以少骨和肉质白嫩晶莹剔透而闻名。犬牙南极鱼属的经济价值比较高，目前的市场平均价格高于金枪鱼的市场平均价格，被称为“白金渔业”。对南极犬牙鱼资源的商业开发和利用，国际上自20世纪70年代中期开始至今有约40年的历史。我国受各种条件限制，还未进行实际的渔业捕捞生产，国内也未见其渔业资源和加工利用方面相关报道。[0003]脂质是一类难溶于水而易溶于非极性溶剂的生物有机分子，主要包括脂肪酸及其天然发生的衍生物，以及与其生物合成和功能相关的化合物。脂类化合物在能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，疾病与免疫等诸多生命过程中是不可或缺的，其异常代谢与糖尿病、动脉硬化症、阿尔茨海默病、胎儿代谢缺陷等都密切相关。由于脂质分子结构的多样性和复杂性，以及相应分析手段的滞后阻碍了人们对生命体的整体脂质及其复杂的代谢网络和功能调控进行规模性、整体性的系统研究。随着20世纪基因组学、蛋白质组学、代谢组学等系统性“组学”概念的兴起，2003年Han等人正式提出了脂质组学这一新的前沿研究领域。脂质组学通过系统分析细胞、体液、组织等脂质及其代谢物，识别关键的脂生物标志物，反映生物种间差异或特定条件下脂质的整体变化。随着对脂质组学研究的逐渐深入，脂质组学的分析方法的建立也越来越多元化，主要有薄层色谱法、气相色谱质谱联用、软电离质谱技术、核磁共振法等。质谱是脂质组学研究最主要的分析仪器，随着软电离离子化技术和高分辨质谱技术的发展及其在脂质分析中的应用，已经实现了对生物样品中各种微量脂质进行快速、高精度的分析检测。基于电喷雾离子化的“鸟枪法”和正相或亲水色谱质谱联用法是脂质组学常用的分析方法。然而，目前的脂质组学质谱方法对样品前处理要求较高，步骤较为复杂，无法满足研究人员对快速、高通量、实时检测的需求。[0004]快速蒸发离子化质谱技术（Rapidevaporativeionizationmassspectrometry,REIMS是一种无须制备或液相色谱分离的新型原位电离质谱技术，使用iKnife、电热探头等手持采样装置直接蒸发样品表面，产生信息丰富的气溶胶并通过离子传输管路进入质谱质量分析器，数秒内提供分析物的准确分子量谱。以REMS为基础的生物组织分析无须任何样品前处理，通常仅需几秒钟的时间即可完成数据采集与分析并实现生物组织识别，精确度达到90%-98%。[0005]iKnife智能手术刀质谱是一种无须任何样品前处理，实时检测样品中目标化合物的一种新型质谱技术。iKnife智能设备基于电外科手术刀开发，由电子刀和质谱分析仪两个部分组成。与传统电子手术刀不同的是，iKnife使用电荷烧灼组织过程中产生气溶胶，经文丘里系统吸入质谱端口并进行化学成分分析，从大数据中提取有用信息并将分析结果投射触摸屏监控器上。目前国内尚未有iKnife相关技术研究报道。[0006]现有的脂质组学轮廓检测方法，无法满足快速、高通量、实时检测的需求。目前针对南极犬牙鱼的脂质组学轮廓检测尚未见报道。发明内容[0007]本发明的目的，是提供一种基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法。本发明可满足快速、高通量、实时检测的需求。[0008]本发明的技术方案:基于RE頂S直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法，包括以下步骤：[0009]A、使用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面，形成气溶胶，所述气溶胶经Venturi栗氮气驱动，采用正交方式经PTFE管引入质谱端口后与1·1Ω、3V、500°C的KanthalAl灯丝碰撞，随后气溶胶中的脂质离子进入质谱仪的StepWave装置并由质量分析器检测，以丙二醇亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂，经针栗注射进样器以O.lmLmin的流量引入端口；质谱仪扫描时间为1秒，扫描范围为mz100-1200;以负电离模式收集数据，获得南极犬牙鱼脂质质谱轮廓图；[0010]B、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、滤噪、中心化和质量校准处理，质谱数据保存为txt文本格式，根据质谱数据得到相对含量为5%以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，结合相对含量为10%以上的离子二级质谱碎片、LipidMSPredictor和LipidMap脂质分子数据库比对确定南极犬牙鱼的脂质组学轮廓。[0011]前述的基于REMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法中，步骤A中，所述iKnife电刀的输出功率为25.08W、切割速度为0.49mms，所述iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面的切割长度为1.03cm。[0012]前述的基于REMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法中，步骤A中，所述丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2。[0013]前述的基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法中，所述南极犬牙鱼的脂质组学轮廓中的磷脂离子的分析为，对南极犬牙鱼脂质组学轮廓图中mz650-1000区域内的质谱图进行降噪、去同位素等处理，筛选峰面积大于3.00E+05的离子峰，计算其离子质量，根据离子质量测定值推算其化学结构，并使用MS2二级质谱进行验证。[0014]与现有技术比较，本发明采用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面直接取样，形成气溶胶，即可实现南极犬牙鱼脂质化合物离子化，并将离子化的南极犬牙鱼脂质化合物由管路传输至质量分析器进行实时检测。质谱仪仅扫描1秒即可得到质谱轮廓图，通过比对数据便可确定样品的脂质组学轮廓。共检出南极犬牙鱼中脂肪酸离子17种，其中信号响应强度最大的为mz327.23,相对含量达到了17.81%，经鉴定其结构为FA22:6,其次分别为mz255.23FA16:0,9.81%，mz281.25FA18:1，9.09%;检出磷脂离子10种，质量范围mz736.49-909.55,信号最强离子峰mz885.55经鉴定为[PI38:4-H]—，相对丰度达到了19.30%，其次为mz790.54[PE40:6-H]—，15.24%。验证得到，目标离子的信噪比为35.4-95.3，质量偏差为4.17-9.78ppm，日内精密度RSD为3.7-5.6%，日间精密度RSD为5.9-7.3%。本发明检测速度快、灵敏度和分辨率高、结果稳定，为脂质组学研究和鱼类生物信息检测提供了新的检测手段。本发明可满足快速、高通量、实时检测的需求。附图说明[0015]图1为RE頂SiKnife直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的检测装置；[0016]图2为输出功率与切割速度等高图；[0017]图3为输出功率与切割速度响应面图；[0018]图4为输出功率与切割长度等高图；[0019]图5为输出功率与切割长度响应面图；[0020]图6为切割速度与切割长度等高图；[0021]图7为切割速度与切割长度响应面图，[0022]图8为南极犬牙鱼脂质组学轮廓图mz200-400区域内的脂肪酸离子峰；[0023]图9为南极犬牙鱼脂质组学轮廓图中mz650-1000区域内的磷脂离子峰。[0024]图中的附图标记为：1-透热发设备，2-iKninfe电刀，3-南极犬牙鱼组织切片，4-气溶胶，5-注射栗即针栗注射进样器），6_质谱仪。具体实施方式[0025]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。[0026]以下是本发明的实验例。[0027]实验例。[0028]1.1试剂与仪器[0029]XevoG2-XS四极杆飞行时间质谱仪，配有iKnife手持采样装置（美国Waters公司）；Pumpllelite针栗注射进样器美国Harvard公司）！Milliplus2150超纯水处理系统美国Millipore公司）；Masslynx4.1数据采集软件和LiveID统计分析软件美国Waters公司）；其它为实验室常用仪器和设备。甲醇、乙腈、丙二醇色谱纯，美国Merck公司）；亮氨酸脑啡肽美国Sigma公司）；实验用水为经Millipore超纯水仪制备的超纯水;南极犬牙鱼组织切片样品由浙江大洋世家股份有限公司提供。[0030]1.2质谱条件[0031]使用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面，生成含有大量复杂离子混合物的形成气溶胶，经Venturi栗氮气驱动，采用正交方式经PTFE管引入质谱端口后与KanthalAl灯丝（I.1Ω，3V，500°C碰撞，随后脂质离子进入质谱仪StepWave装置并由质量分析器检测分析，实验装置如图1;以丙二醇亮氨酸脑啡肽混合物丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2为辅助溶剂，经针栗注射进样器以O.lmLmin的流量引入端口，用于清洗杂质、提高信号强度、锁定质量校正;质谱仪扫描时间：1秒;扫描范围:mz100-1200;所有数据均以负电离模式收集。[0032]1.3数据分析[0033]将质谱图经MassLynx进行峰匹配、滤噪、中心化和质量校准处理，结果（即质谱数据保存为txt文本格式。根据质谱数据得到相对含量为5%以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，结合相对含量为10%以上的离子二级质谱碎片、LipidMSPredictor和LipidMap脂质分子数据库比对确定或推测脂质的结构信息。[0034]2结果与讨论[0035]2.1iKnife离子化条件优化[0036]南极犬牙鱼是一种高蛋白、低脂肪鱼类，其肌肉组织低脂特性对RE頂S检测结果的影响较大。前期实验研究发现，iKnife在电切禽畜类肌肉或内脏组织时，离子信号响应较强、信噪比较高；电切鱼类组织，尤其是犬牙鱼等低脂鱼类肌肉组织时，脂质离子较难被检测到，噪音影响显著。因此，首先对iKnife电切条件进行优化，调整输出功率、电切速度、采样长度参数，以获得稳定、可靠的南极犬牙鱼肌肉组织脂质组学轮廓图谱。[0037]使用响应面法优化实验参数，以Box-Benhnken设计原理，选取磷脂离子母峰mz885.55的信噪比作为响应值，输出功率、切割速度、切割长度为实验因素，设计优化不同实验条件组合，得到结果如表1。[0038]表IiKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片条件优化[0040]利用DesignExpert8.0软件对表1中的实验数据进行回归分析及拟合，得到的信噪比回归方程为：[0041]SN=46·44+0·19A-0·30B+0·51C+1·87AB-0·6AC+0·47C-2·07Α2-2·84B2-3·47C2[0042]由表2方差结果得出模型P〈0.0001极显著，失拟项P=0.1604不显著，R2=O.9766，该回归方程与实际数据拟合度较高。[0043]表2方差结果[0045]根据图2至图7所示的3因素响应面与等高线图，最优化分析后得出最佳提取条件为：能量（输出功率）25.08W、切割速度0.49mms、切割长度1.03cm，信噪比预测值为46.4656。为便于实际操作，将实验条件调整为：能量251、切割速度0.5〇1111118、切割长度1.0cm。在最佳条件下进行5次重复实验，验证得到实际信噪比平均值为46.32±1.21%，此优化条件有效。[0046]2.2脂肪酸离子分析[0047]使用iKnife手持采样的REIMS技术无须任何样品前处理，通过对组织样品表面离子化，实时获得质谱轮廓图，经LiveID等软件识别，并对特征离子峰降维、建模后，可实现未知样品的实时鉴定与准确度评分。由于前端并未串联液相色谱等分离技术，目前REHlS相关研究主要以定性为主。因此，本实验研究目的主要为获得低脂鱼类南极犬牙鱼的脂质组学轮廓图，对各脂质分子的绝对含量定量方法未做深入研究。[0048]通过对南极犬牙鱼肌肉组织进行电切离子化，扫描范围mz100-1200,同时以亮氨酸脑啡肽mz554.2615为内标锁定质量并校准质量轴。图8为南极犬牙鱼脂质组学轮廓图mz200-400区域内脂肪酸离子峰，区域内离子较多，且基质噪音也较为明显;通过对其鉴定和积分，得到结构和相对含量见表3。脂肪酸离子特征表现为，根据偶氮规则，其在质谱图中质量数通常为奇数。实验共检出脂肪酸离子17种，其中信号响应强度最大的为mz327，相对含量达到了17.81%，经鉴定其结构为FA22:6，即所熟知的DHA。其次分别为mz255FA16:0,9.81%，mz281FA18:1，9.09%。1112375、mz389等疑似为超长链脂肪酸FA24:3Ep2.79%、FA26:32.96%，其存在可能与南极犬牙鱼受极寒环境胁迫，促使其代谢产生长链脂肪酸以提高体液流动性相关;相关假设尚须生物学进一步验证。[0049]表3南极犬牙鱼脂质组学轮廓图mz200-400区域内脂肪酸离子的结构和相对含量[0052]2.3磷脂离子分析[0053]对质谱图9降噪、去同位素等处理，筛选峰面积大于3.00E+05的离子峰，根据其分子质量测定值推算其可能的化学结构，并使用MS2二级质谱进行验证。以mz883.53为例，其离子质量与[PI38:5-H]—C47H80013P—，883.5342最为接近，通过子离子扫描Productionscan将母离子解离得到，可观察到由mz883.53断裂的脂肪酸链子离子mz283.2FA18:0和mz301.1FA20:5，碳原子数和双键数与前期推测38:5吻合，故此可确认mz883.53为[PI38:5-H]。通过这种方法可对大多数磷脂离子结构进行确认，部分低丰度离子因为子离子信号响应不足未做MS2确认。南极犬牙鱼肌肉组织中共鉴定磷脂离子峰10种，质量范围mz736.49-909.55，根据峰面积采用归一化法计算相对丰度，RSD为3.28-6.21%。信号最强离子峰mz885.55经鉴定为[PI38:4-H]，相对丰度达到了19.30%;其次为1^790.54邮40:6-扣），相对丰度为15.24%。生物体中含量最多的？：分子检出较少，原因可能是iKnife输出能量较高，电切过程中通过电能传输导致PC丢失胆碱基团而生成[PA-H]—离子，印证了结果中较多[PA-H]—离子的检出，如mz747.50[PA40:6-H]—、mz763.56[PA0-42:5-H]等。南极犬牙鱼脂质组学轮廓图mz650-1000区域内磷脂离子离子的结构和相对含量见表4。[0054]表4南极犬牙鱼脂质组学轮廓图mz650-1000区域内磷脂离子离子的结构和相对含量[0056]2.4方法学验证[0057]为验证本实验基于REMS的南极犬牙鱼脂质组学轮廓方法的可靠性，选取主峰脂肪酸离子1112281.25、1112327.24和磷脂离子1112790.54、1112885.55为特征脂质离子峰对灵敏度、选择性、精确度等参数进行方法学验证。对由于组织样品无法构建标准逐级稀释体系，本实验采用目标脂质信噪比为指标研究方法灵敏度。研究结果显示，目标脂质的信噪比为35.4-95.3，方法灵敏度较高，鉴于南极犬牙鱼为低脂鱼类，对于脂质含量更高的中脂、高脂鱼类理论上同样适用。通过计算目标离子的实际测量值和理论值的偏差确定高分辨质谱的选择性，目标脂质离子的偏差为4.17-9.78ppm，表明方法分辨率高、选择性较好，使用相对分子质量对脂质结构鉴定具有较大的指导意义。方法精密度通过日内和日间精密度测量，使用iKnife连续平行切割南极犬牙鱼肌肉组织5次，并计算目标脂质离子峰面积的RSD，得到日内精密度；以相同实验条件连续平行测试7天，计算RSD获得日间精密度。其中日内精密度的RSD为3.7-5.6%，日间精密度的RSD为5.9-7.3%，本实验方法精密度好，检测结果稳定。基于RE頂S直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法验证见表5。[0058]表5基于RE頂S直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法验证[0060]3结论[0061]建立了基于iKnife手持采集的REIMS方法，用于检测南极犬牙鱼的脂质组学轮廓。通过响应面优化各项参数后，实现了低脂肌肉组织中脂质的离子化，成功检出17种脂肪酸离子和10种磷脂离子。该方法无需样品前处理，可实现南极犬牙鱼肌肉组织脂质组学轮廓的实时检测，方法选择性、灵敏度、稳定性均较优，为脂质组学研究提供了新的技术手段。[0062]以下是本发明的实施例。[0063]实施例。[0064]基于RE頂S直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法，包括以下步骤：[0065]A、使用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面，形成气溶胶，所述气溶胶经Venturi栗氮气驱动，采用正交方式经PTFE管引入质谱端口后与1·1Ω、3V、500°C的KanthalAl灯丝碰撞，随后气溶胶中的脂质离子进入质谱仪的StepWave装置并由质量分析器检测，以丙二醇亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂，经针栗注射进样器以O.lmLmin的流量引入端口；质谱仪扫描时间为1秒，扫描范围为mz100-1200;以负电离模式收集数据，获得南极犬牙鱼脂质质谱轮廓图；[0066]B、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、滤噪、中心化和质量校准处理，质谱数据保存为txt文本格式，根据质谱数据得到相对含量为5%以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，结合相对含量为10%以上的离子二级质谱碎片、LipidMSPredictor和LipidMap脂质分子数据库比对确定南极犬牙鱼的脂质组学轮廓。[0067]步骤A中，所述iKnife电刀的输出功率为25.08W、切割速度为0.49mms，所述iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面的切割长度为1.03cm。[0068]步骤A中，所述丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2。[0069]所述南极犬牙鱼的脂质组学轮廓中的磷脂离子的分析为，对南极犬牙鱼脂质组学轮廓图中mz650-1000区域内的质谱图进行降噪、去同位素等处理，筛选峰面积大于3.OOE+05的离子峰，计算其离子质量，根据离子质量测定值推算其化学结构，并使用MS2二级质谱进行验证。[0070]当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

权利要求：1.基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、使用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面，形成气溶胶，所述气溶胶经Venturi栗氮气驱动，采用正交方式经PTFE管引入质谱端口后与1.1Ω、3V、500°C的KanthalAl灯丝碰撞，随后气溶胶中的脂质离子进入质谱仪的StepWave装置并由质量分析器检测，以丙二醇亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂，经针栗注射进样器以O.lmLmin的流量引入端口；质谱仪扫描时间为1秒，扫描范围为mz100-1200;以负电离模式收集数据，获得南极犬牙鱼脂质质谱轮廓图；B、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、滤噪、中心化和质量校准处理，即质谱数据保存为txt文本格式，根据质谱数据得到相对含量为5%以上的离子峰的质荷比和峰面积信息，结合相对含量为10%以上的离子二级质谱碎片、LipidMSPredictor和LipidMap脂质分子数据库比对确定南极犬牙鱼的脂质组学轮廓。2.根据权利要求1所述的基于REMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法，其特征在于：步骤A中，所述iKnife电刀的输出功率为25.08W、切割速度为0.49mms，所述iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面的切割长度为1.03cm。3.根据权利要求1所述的基于REMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法，其特征在于:步骤A中，所述丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2。4.根据根据权利要求1所述的基于REIMS直接采样检测南极犬牙鱼脂质组学轮廓的方法，其特征在于:所述南极犬牙鱼的脂质组学轮廓中的磷脂离子的分析为，对南极犬牙鱼脂质组学轮廓图中mz650-1000区域内的质谱图进行降噪、去同位素等处理，筛选峰面积大于3.00E+05的离子峰，计算其离子质量，根据离子质量测定值推算其化学结构，并使用MS2二级质谱进行验证。

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