申请/专利权人：中山大学

申请日：2019-09-18

公开（公告）日：2020-03-27

公开（公告）号：CN110923229A

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);C12N15/90(20060101);C12Q1/6858(20180101);A01K67/027(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.03.15#授权;2020.04.21#实质审查的生效;2020.03.27#公开

摘要：本发明公开了一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPRCas9系统，所述CRISPRCas9系统包括以下步骤：1靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上；2根据步骤1的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1E1F和dmrt1E1R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1E3F和dmrt1E3R扩增靶位点2及附近序列；3以pUC19‑gRNA‑scaffold质粒为模板，用dmrt1E1gRNAF和gRNAR进行gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1E3gRNAF和gRNAR进行gRNA2片段的PCR扩增；以上述PCR产物为模板，体外转录并纯化获得gRNA；4以pXT7‑hCas9线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9mRNA；5将Cas9mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中；6检测突变类型，计算基因编辑率。

主权项：1.一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPRCas9系统，其特征在于，所述CRISPRCas9系统包括以下步骤：1靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上；2根据步骤1的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1E1F和dmrt1E1R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1E3F和dmrt1E3R扩增靶位点2及附近序列；3以pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板，用dmrt1E1gRNAF和gRNAR进行gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1E3gRNAF和gRNAR进行gRNA2片段的PCR扩增；以上述PCR产物为模板，体外转录并纯化获得gRNA；4以pXT7-hCas9线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9mRNA；5将Cas9mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中；6检测突变类型，计算基因编辑率。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中山大学 一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用

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