申请/专利权人：上海大学

申请日：2018-04-28

公开（公告）日：2021-04-09

公开（公告）号：CN108660242B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.09#授权;2018.11.09#实质审查的生效;2018.10.16#公开

摘要：本发明涉及一种扩增检测玉米dek10基因用分子标记的特异性引物组及其应用。该特异性引物组中扩增该dek10基因左侧DNA片段的一对特异性引物AC204.28的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：TGACGATGGTCCTTGATTCT；反向引物从5′端至3′端为：CCGTGGTCCGTAGCTC；扩增该dek10基因右侧DNA片段的一对特异性引物GM168.7的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：GTTTCACTTTCTACCCTCGC；反向引物从5′端至3′端为：ATTAATTAAGAACTGCAGCAGGA。利用这两对特异性引物组能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中dek10基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用dek10基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

主权项：1.一种扩增检测玉米dek10基因用分子标记的特异性引物组在检测和区分野生型自交系郑58、B73和Mo17类型以及他们杂交子代类型中的应用，所述扩增检测玉米dek10基因用分子标记的特异性引物组的特异性引物组中扩增该dek10基因左侧DNA片段的一对特异性引物AC204.28的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：TGACGATGGTCCTTGATTCT；反向引物从5′端至3′端为：CCGTGGTCCGTAGCTC；扩增该dek10基因右侧DNA片段的一对特异性引物GM168.7的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：GTTTCACTTTCTACCCTCGC；反向引物从5′端至3′端为：ATTAATTAAGAACTGCAGCAGGA。

全文数据：扩増检测玉米dek10基因用分子标记的特异性引物组及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种扩增检测玉米CfeWO基因用分子标记的特异性引物组及其应用。技术背景[0002]玉米ZeanaysL.是一年生草本植物，隶属于禾本科玉米属。原产于中美洲，是世界三大粮食作物之一。玉米的适应性很强，分布广，用途多，增产潜力大，在全世界播种面积和总产量仅次于水稻和小麦，居第三位。我国不仅是世界玉米的主要生产国，也是玉米的主要消费国。现今全世界约有三分之一人口以玉米作为主要食粮。玉米同时是家畜、家禽的上等精饲料，对提高猪肉、牛乳和蛋类产品的产量和品质有显著作用。玉米还是主要的工业原料，被广泛用于食品、医药、纺织等工业部门。我国对于玉米的消费量和需求一直在不断的增长中。因此，这对玉米产量和品质的改良与创新提出了更高的要求。[0003]为了提高玉米品质，国内外科研人员利用生物学的方法对玉米的品质进行大量的试验摸索和改造尝试。其基本原理是，以玉米中一些籽粒的突变体为材料，运用分子生物学和遗传学方法对其进行相关基因的克隆和研究，从而借助遗传学的手段提高其营养价值。在玉米中，有一类与蛋白品质相关的突变体，被称为opaque或floury突变体。在表型上，这类突变体胚乳细胞内的主要储藏细胞器淀粉粒和蛋白体包装不紧密，造成籽粒胚乳结构疏松，比较容易粉碎，所以与野生型的透明籽粒相比容易消化，适口性好，更适合用于优质饲料的加工。其中最为有名的是opagueS突变体。opagueS突变体具有粉质的、不透光的胚乳表型。opaque基因可以显著降低醇溶蛋白在胚乳蛋白中的比例、显著提高玉米籽粒胚乳蛋白中赖氨酸含量，从而提高籽粒品质。fiouiyj是另一个比较有名的籽粒粉质突变体。fB通过改变22kD醇溶蛋白在蛋白体中的定位来影响蛋白体的合成，从而形成粉质的胚乳表型。[0004]deWO是一个具有类似粉质胚乳表型的籽粒发育缺陷突变体。对deWO突变体的遗传学分析表明WeW0是单基因控制的隐性突变，能够引起玉米籽粒的不透明表型，参见图1。遗传学研究将ceW0基因定位在4号染色体上。0基因至今尚未通过杂交育种被很好地利用，主要是因为CfeWO由隐性基因突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。借助DNA分子标记辅助育种，利用网上玉米基因组序列信息结合相关生物信息学软件的分析进行了SSR、InDel等分子标记的开发，筛选出多态性良好的分子标记用于对群体材料的检测。最终通过对大规模突变体籽粒群体进行检测，将daWO基因限定在2号染色体短臂上AC204.28和GM168.7之间区间内。[0005]DNA分子标记辅助育种技术的关键是：（1获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本纯合类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代Fl代的共显性引物组；（2获得的共显性分子标记（即引物组与控制目标性状基因的连锁情况，连锁越紧密在其后代中错选的概率越低，如果该标记来源于控制目标性状基因，则利用该分子标记在其后代中错选的概率为零；（3该标记可以区分突变体与国内所有主要育种亲本。以往研究中并没有获得位于cieAiO基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记（即引物组），故无法对该基因所控制的目标性状进行DNA分子标记辅助选择，同时，以往也未获得能够区分突变体与国内所有主要育种亲本的分析标记。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对控制玉米籽粒硬度农艺性状的cieAi〇基因进行DNA分子标记辅助育种的基础。发明内容[0006]本发明的目的之一在于提供一种扩增检测玉米deid0基因用分子标记的特异性引物组。[0007]本发明的目的之二在于提供该特异性引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本中的应用。[0008]本发明的目的之三在于提供该特异性引物组在检测和区分野生型自交系W22、昌7-2、郑58、B73和M〇17类型以及他们杂交子代类型中的应用。[0009]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种扩增检测玉米cfeidO基因用分子标记的特异性引物组，其特征在于该特异性引物组中扩增该cfeW0基因左侧DNA片段的一对特异性引物AC204.28的碱基序列为：正向引物从5端至3端为:TGACGATGGTCCTTGATTCT;反向引物从5端至3端为:CCGTGGTCCGTAGCTC;扩增该deWO基因右侧DNA片段的一对特异性引物GM168.7的碱基序列为：正向引物从5端至3端为:GTTTCACTTTCTACCCTCGC;反向引物从5端至3端为:ATTAATTAAGAACTGCAGCAGGA。[0010]—种上述的扩增检测玉米deidO基因用分子标记的特异性引物组在在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。[0011]—种上述的扩增检测玉米deidO基因用分子标记的特异性引物组在检测和区分野生型自交系W22、昌7-2、郑58、B73和M〇17类型以及他们杂交子代类型中的应用。[0012]本发明提供的2个位于deidO基因染色体物理位置两侧的与其紧密连锁的共显性DNA特异性引物组，以及利用这两个共显性DNA特异性引物组对cfeid0基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这两个特异性引物组能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用cfeid0基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。附图说明[0013]图1是deWO纯合突变体WeWOdeidO和野生型deWO十或十十）籽粒宏观表型；图2是deid0纯合突变体籽粒与野生型相比发芽率降低、植株矮小；图3是用于deid0基因克隆的F2群体构建路线；图4是标记AC204.28在W64A背景F2群体中的分离情况，deid0deid0为纯合突变体；deWO+是杂合体；++为纯合野生型；图5是标记61168.7在164六背景？2群体中的分离情况，办]^0也]^0为纯合突变体；deWO+是杂合体；++为纯合野生型；图6是本发明中分子标记在玉米4号染色体短臂上的示意位置，其中CEM代表4号染色体着丝粒，TEL代表端粒；图7是标记AC204.28在不同自交系间的多态情况；图8是标记GM168.7在不同自交系间的多态情况。具体实施方式[00M]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.或植物分子生物学一实验手册（PlantMolecularBiology-ALaboratoryManual,MelodyS·Clark编，Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0015]实施例一:两个共显性分子标记的获得本发明通过经典的遗传定位获知CieidO基因定位在玉米第4号染色体的长臂上。通过在dakiO位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的F2群体，参见图3,提取纯合突变体、野生型以及F2群体各单株的基因组DNA。通过筛选已有的SSR分子标记，获取有多态性的331?类型分子标记4：196.1与40200.20，将也妃0基因定位于分子标记4：196.1与40200.20之间。然而这两个标记和cieidO的连锁性并不十分紧密，在实际使用上仍有一定的问题。因此根据ACl96.1与AC200.20之间已知的B73基因组序列http:www.genome.arizona.edufpcmaize，设计引物。通过测序以及序列比对，获得纯合突变体与纯合野生型亲本间的序列差异，并通过所测序列开发标记，获得能够区分育种过程中杂交亲本纯合CieAiO类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代Fl代）的共显性InDel分子标记AC204.28与GM168.7。[0016]扩增DNA片断AC204.28的特异性引物及碱基序列为：正向引物从5端至3端为:TGACGATGGTCCTTGATTCT;反向引物从5端至3端为:CCGTGGTCCGTAGCTC;扩增DNA片断GM168.7的特异性引物及碱基序列为：正向引物从5端至3端为:GTTTCACTTTCTACCCTCGC;反向引物从5端至3端为:ATTAATTAAGAACTGCAGCAGGA。[0017]反应体系如下：PCR反应条件为：T=94°Cfor5’00〃T=94°Cfor0’30〃T=6TCfor0,30"T=72°Cfor0’30〃35cyclesT=4°Cforever实施例二:分子标记AC204.28与GM168.7与deid0连锁关系的确定分别抽提deAiOAieAiO与W64A背景杂交后获得的F2群体中的籽粒的DNA用于分子标记AC204.28与GM168.7与deWO连锁关系的分析，野生型表型的基因型包括++和deWO+，deidO纯合突变体的基因型为deidOAieidO。以这些样本来分析分子标记AC204.28与GM168.7与deid0基因的遗传连锁关系，参见图4和5。分析结果表明，这两个标记与deid0基因连锁，大群体分析表明，在W64A背景的分离群体中，标记AC204.28的交换率为3.1XHT3，标记GM168.7的交换率为2.4X10_3。分子标记AC204.28与GM168.7与deWO基因在染色体上的物理位置关系，参见图6。[0018]实施例三:分子标记在不同亲本间的多态性鉴定提取deWO和5种育种中广泛使用的自交系W22、W64A、郑58、B73和Mol7的基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记AC204.28可以区别deidO与W22，W64A，郑58和Mol7自交系，分子标记GM168.7也可以区别deidO与W22和W64A自交系，参见图7和图8。此结果证明，分子标记AC204.28与GM168.7能够在W22等背景群体中准确检测到cfeidO基因的存在，辅助选择时的错选率为7.4ΧΠΓ6,可以满足选择要求。

权利要求：1.一种扩增检测玉米CieWO基因用分子标记的特异性引物组，其特征在于该特异性引物组中扩增该cfeWO基因左侧DNA片段的一对特异性引物AC204.28的碱基序列为：正向引物从5端至3端为:TGACGATGGTCCTTGATTCT;反向引物从5端至3端为:CCGTGGTCCGTAGCTC;扩增该deWO基因右侧DNA片段的一对特异性引物GM168.7的碱基序列为：正向引物从5端至3端为:GTTTCACTTTCTACCCTCGC;反向引物从5端至3端为:ATTAATTAAGAACTGCAGCAGGA。2.—种根据权利要求1所述的扩增检测玉米deidO基因用分子标记的特异性引物组在在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。3.—种根据权利要求1所述的扩增检测玉米deidO基因用分子标记的特异性引物组在检测和区分野生型自交系W22、昌7-2、郑58、B73和M〇17类型以及他们杂交子代类型中的应用。

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