申请/专利权人：南昌大学

申请日：2018-08-02

公开（公告）日：2021-11-19

公开（公告）号：CN109112154B

主分类号：C12N15/74(20060101)

分类号：C12N15/74(20060101);C12N15/13(20060101);C12N1/21(20060101);A61P35/00(20060101);C12R1/42(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.11.19#授权;2019.01.25#实质审查的生效;2019.01.01#公开

摘要：本发明公开了Caspase‑3重组单链抗体的构建及功能验证的方法：包括以下步骤1构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala重组质粒；2构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009重组菌株；3Caspase‑3重组质粒通过减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009胞内侵袭的特性,侵入细胞后实现蛋白Caspase‑3的真核表达，验证这种蛋白对细胞的杀伤作用。本发明中采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的胞内侵袭的特性实现人源毒素蛋白的表达，同时大量研究表明减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009能够特异性聚集在实体肿瘤中，可以实现特异性杀伤肿瘤细胞的目的，为肿瘤治疗研究提供实验依据。

主权项：1.重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP20009的构建方法，其特征是，所述构建方法包括如下步骤：1获取Caspase-3-Gala片段：以pET302-Caspase-3-Gala为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列为引物，PCR扩增获得SEQIDNo.1所示的Caspase-3-Gala片段；2构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组质粒：将步骤1中获得的Caspase-3-Gala片段，通过酶切酶连的方法连接到pcDNA3.3c其序列为：SEQIDNo.2质粒中，重组质粒命名pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala；3构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组菌株：将步骤2中的pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组质粒转入E.coliTop10中，获得重组菌株；4构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009：从步骤3中获得的重组菌株中获得重组质粒后，通过电转化的方法置于鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，电转条件：1800V、25uF、200Ω、4.7ms，将重组后的鼠伤寒沙门氏菌命名pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP20009。

全文数据：Caspase-3重组单链抗体的构建及功能验证的方法技术领域本发明属于生物制药、肿瘤医学领域，主要涉及Caspase-3重组单链抗体的构建及功能验证的方法。背景技术Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，处于凋亡级联反应通路的核心位置，是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路。Caspase-3正常以酶原32KDa的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基17KDa和两个小亚基12KDa组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。本发明以减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009作为治疗载体，综合应用了减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性和特异性聚集在实体瘤中的性质，进一步扩大了本发明中肿瘤杀伤的特异性。现今，在临床上对于癌症的治疗，提出了抗体药物偶联物AntibodyDrugConjugates，ADC的一类新颖的治疗药物，本发明应用这一概念，结合实验前期基础，为ADC药物治疗的发展提供了一定的实验数据基础。发明内容本发明的目的在于提供了一种真核质粒表达过程的减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的质粒转染技术。本发明第二个目的是成功构一株重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP20009，具有特异性杀伤肿瘤细胞的效果。Caspase-3重组单链抗体的构建方法，包括如下步骤：1获取Caspase-3-Gala片段以pET302-Caspase-3-Gala为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列为引物，PCR扩增获得SEQIDNo.1所示的Caspase-3-Gala片段；2构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组质粒：将步骤1中获得的Caspase-3-Gala片段，通过酶切酶连的方法连接到pcDNA3.3c其序列为：SEQIDNo.2质粒中，重组质粒命名pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala；3构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组菌株：将步骤2中的pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组质粒转入E.coliTop10中，获得重组菌株；4构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009：从步骤3中获得的重组菌株中获得重组质粒后，通过电转化的方法置于鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，电转条件：1800V、25uF、200Ω、4.7ms，将重组后的鼠伤寒沙门氏菌命名为pcDNA3.3c-GrB-Caspase-3-Gala-VNP20009。一株重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP20009。Caspase-3重组单链抗体功能验证的方法，包括如下步骤：1将步骤1获得的这种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，按照细胞与细菌100:1的比例，与B16F10细胞混合培养2小时后，换取含有青链霉素的新鲜培养基继续培养24h。2将步骤1中培养的细胞，分别做拍照观察及采用MTT比色法计算该蛋白对细胞的特异性的杀伤作用。上述步骤采用的是真核质粒转染、表达的技术。本发明的有益技术效果：1本发明采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009介导真核质粒转染细胞，实现真核表达，为后续采用细菌治疗手段提供实验依据；2本发明利用单链抗体的靶向特异性和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009在实体瘤中特异聚集的性质，结合人源毒素Caspase-3的细胞杀伤作用，属于抗体药物偶联物这种新型治疗药物，能更好的实现特异性杀伤细胞效果。附图说明图1pcDNA3.3cCaspase-3-GalaPCR验证结果，a：Marker-DL2000，b：pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala质粒，c：Caspase-3-Gala片段；图2Caspase-3蛋白对细胞杀伤能力的显微示意图；图3Caspase-3蛋白对细胞杀伤能力MTT检测结果。具体实施方式本发明原始质粒均来源于BiovectorNCTT公司。本发明中E.coliTop10和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009均购自BiovectorNCTT公司。所用限制性内切酶均购自NEB公司。所用T4DNA连接酶均购自Takara公司。所用DNA连接酶均购自Takara公司。LB固体培养基和液体培养基均购自索莱宝公司。实施例1以pET302-Caspase-3-Gala为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列为引物，PCR扩增获得SEQIDNo.1所示的Caspase-3-Gala片段。实施例2已获得的Caspase-3-Gala片段和质粒pcDNA3.3c，经AgeI和BsiwI双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到pcDNA3.3cSEQIDNo.2质粒中，重组质粒命名为pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala。见说明书附图1。实施例3将-80℃保存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mlLB中，37℃振荡培养12h；按1：100比例接种于100mlLB中振荡培养至细菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀用110体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1100体积预冷的10％甘油中，制成VNP20009感受态分装后-80留存备用。实施例4将已获得的重组质粒pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，采用0.1cm电转杯，条件设置为：1.8kv、200Ω、25uF，电转4.7ms；通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，命名为pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP2000。实施例5将B16F10细胞按照10000孔，接种于96孔板采用不含青霉素和链霉素的培养基，将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009按照B16F10细胞：重组细菌＝100：1的比例接种于96孔板中，总体积200μL，培养2h后，更换为含有青霉素和链霉素的培养基混合培养24h，采用MTT比色法检测这种蛋白对细胞的特异性杀伤作用。序列表110南昌大学120Caspase-3重组单链抗体的构建及功能验证的方法13020181604170SIPOSequenceListing1.02105211792212DNA213人工序列无4005tctggaatatccctggacaacagttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtata60ataattaataataagaattttcataaaagcactggaatgacatctcggtctggtacagat120gtcgatgcagcaaacctcagggaaacattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaa180aatgatcttacacgtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatgtttctaaagaagatcac240agcaaaaggagcagttttgtttgtgtgcttctgagccatggtgaagaaggaataattttt300ggaacaaatggacctgttgacctgaaaaaaataacaaactttttcagaggggatcgttgt360agaagtctaactggaaaacccaaacttttcattattcaggcctgccgtggtacagaactg420gactgtggcattgagacagacagtggtgttgatgatgacatggcgtgtcataaaatacca480gtggaggccgacttcttgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaat540tcaaaggatggctcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgac600aagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgag660tccttttcctttgacgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatg720ctcacaaaagaactctatttttatcacggaggtggtggaagtggaggtggaggatctgga780ggtggaggttcc79221062111288212DNA213人工序列无4006gttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgatta60ttgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggag120ttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgc180ccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattga240cgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcat300atgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcc360cagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgct420attaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactca480cggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaat540caacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtagg600cgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctgg660agacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgg720actctagaggatcgaacccttactagtgccaccatggagtttgggctgagctgggtcttc780ctggtggctatcttgaagggtgtccagtgtgaggtggctagcgaattcaagcttcccggg840gtcgacctgcaggagctcctcgagagatctggatcccaccatcaccaccatcaccaccac900gggtgagcggccgcttcatgaagggttcgatccctaccggttagtaatgagtttaaacgg960gggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggca1020ataaaaagacagaataaaacgcacgggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcg1080gtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccg1140cgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagc1200caacgtcggggcggcaggccctgccatagcagatctgcgcagctggggctctagggggta1260tccccacgcgccctgtagcggcgcatta1288210721128212DNA213人工序列无4007ataggctgagagtcggcgacacggccac28210821129212DNA213人工序列无4008cgacagagtgccagccctgggaccgaacc29

权利要求：1.Caspase-3重组单链抗体的构建及功能验证的方法，其特征是，所述构建方法包括如下步骤：1获取Caspase-3-Gala片段以pET302-Caspase-3-Gala为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列为引物，PCR扩增获得SEQIDNo.1所示的Caspase-3-Gala片段；2构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组质粒：将步骤1中获得的Caspase-3-Gala片段，通过酶切酶连的方法连接到pcDNA3.3c其序列为：SEQIDNo.2质粒中，重组质粒命名pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala；3构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组菌株：将步骤2中的pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组质粒转入E.coliTop10中，获得重组菌株；4构建pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009：从步骤3中获得的重组菌株中获得重组质粒后，通过电转化的方法置于鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，电转条件：1800V、25uF、200Ω、4.7ms，将重组后的鼠伤寒沙门氏菌命名为pcDNA3.3c-GrB-Caspase-3-Gala-VNP20009。2.权利要求1的方法构建的一株重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP20009。3.根据权利要求1所述的Caspase-3重组单链抗体的构建及功能验证的方法，其特征是所构建抗体功能验证方法包括如下步骤：1将步骤1获得的这种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，按照细胞与细菌100:1的比例，与B16F10细胞混合培养2小时后，换取含有青链霉素的新鲜培养基继续培养24h；2将步骤1中培养的细胞，分别做拍照观察及采用MTT比色法计算该蛋白对细胞的特异性的杀伤作用。4.根据权利要求1中所述Caspase-3重组单链抗体的构建及功能验证的方法，其特征是：采用的是真核质粒转染、表达的技术。

百度查询： 南昌大学 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP20009的构建方法及功能验证方法

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