申请/专利权人：成程科技集团有限责任公司

申请日：2022-04-12

公开（公告）日：2022-06-10

公开（公告）号：CN114606290A

主分类号：C12Q1/02

分类号：C12Q1/02;G01N33/574;G01N33/569;G01N33/58;C12N5/09;C12N5/071

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2023.08.25#发明专利申请公布后的撤回;2022.06.28#实质审查的生效;2022.06.10#公开

摘要：本发明提供了人参根体外抑制HBsAg和HBeAg的作用效果的研究方法，具体包括以下步骤：实验用试剂的配置、细胞处理和实验结果分析。本发明提供的研究方法，能够系统有效的验证人参根对HBsAg和HBeAg的抑制作用，便于人参根在乙型肝炎治疗中应用。

主权项：1.人参根体外抑制HBsAg和HBeAg的作用效果的研究方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1、实验用试剂的配置0.25％胰蛋白酶：0.22μm滤膜过滤后使用15mlBD管分装，标明日期，置于-20℃冰箱保存，使用前半小时放置于37℃水浴中预热；细胞完全培养基：将5ml胎牛血清、0.019gG-418及DMEM培养液混匀后配制成50ml含有10％FBS的完全培养基，0.22μm滤膜过滤后加入50mlBD管中于4℃冰箱保存，使用前半小时置于37℃水浴中预热；MTT的制备：称取0.015g的MTT粉，融于3mlPBS液中，过膜，配置成5μgml的MTT溶液，置于-20℃冰箱中避光保存，使用前半小时置于37℃水浴中预热；药物加工制备：将浓缩后的人参根液加氯化钠制备成0.9％渗透压，高压灭菌后，置于4℃冰箱密封保存备用；阳性药物拉米夫定的制备：精确称取拉米夫定4mg，用4mLDMEM高糖培养基溶解，以0.22μm的微孔滤膜过滤后，最后用含有10％的胎牛血清的DMEM高糖培养基将其稀释成实验所需浓度；步骤2、细胞处理复苏细胞：将含有1ml细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5ml培养基混合均匀，在1000RMP条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6ml完全培养基后吹匀，然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜，第二天弃去培养液，用不含钙、镁离子的PBS液冲洗2遍后，再加入新培养液培养，每两天换一次液；细胞传代：每天观察培养，显微镜下观察细胞密度达80％-90％，即可进行传代培养；细胞计数：细胞传代时进行此步骤，离心后，弃上清，加1mL培养基重悬细胞，取50μL悬液用DMEM培养基将其稀释40倍，然后取10μl稀释液加入到细胞计数板中，数四大方格的细胞数，计算细胞数：细胞数mL＝四大方格的细胞数之和4×104×稀释倍数40倍，用完全培养基将已计数好的细胞悬液稀释至1×105mL，接种到细胞培养瓶中；细胞冻存：培养瓶中细胞生长至90％后，加1-2ml消化液0.25％Trypsin-0.53mMEDTA于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后再显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10％血清的完全培养基终止消化；轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RMP条件下离心5分钟，弃去上清液，用1-2ml冻存液将细胞重悬，分装于冻存管中，在管壁上标记细胞名称、日期和姓名放置冻存盒，-20℃放置过夜后，转移至-80℃冰箱中冻存；细胞接种：收集对数生长期细胞，将浓度调整至1×105个ml后接种于96孔板，每孔加入100μL，96孔板周围加PBS液液100μl，保持湿度，于37℃恒温培养箱中培养，24h后观察细胞贴壁状态；选择对照试剂：选择对应浓度生理盐水，PBS液，无菌水的培养基作为对照组，将浓缩10倍的药物加氯化钠制备成0.9％渗透压，高压灭菌后，每孔分别加入100μL含有5、10、20、30、40、50、60、70、80μl100μl浓度的药物的培养基作为给药组，另设空白组，置于37℃恒温培养箱中继续培养；药物作用细胞72h后，每孔加入20μlMTT溶液5mgml混匀，连续孵育4小时后取出，吸弃孔内上清液，每孔加150μlDMSO，振荡，使紫色结晶物充分溶解，用酶标仪在490nm的波长测定其OD值，比较不同对照组的吸光度OD值变化，从而选择合适的对照组；G-CQDS的细胞毒性实验：用MTT法检测G-CQDS对HepG2.2.15细胞的毒性；取对数生长期的HepG2.2.15，用0.25％的胰酶消化，用含10％胎牛血清的培养基配制成1×105个mL-1细胞的细胞悬液，分别接种于96孔板，每孔加100μl，每组设3个复孔，继续培养24h后，实验组分别加入浓缩10倍后的G-CQDS5、10、20、30、40、50、60、70、80μl100μl的G-CQDS，并设置3个复孔的生理盐水对照；药物作用72h后弃去上清液，每孔中加入20μL含0.5％MTT溶液的DMEM培养基，置37℃、5％CO2培养箱中继续培养4h，小心吸去孔内培养液，每孔中加入150μLDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在ELX800酶标仪上，于490nm处测量各孔的吸光值；绘制细胞生长曲线，计算细胞抑制率，IR＝OD对照组-OD实验组OD对照组×100％；HepG2.2.15细胞上清液的收集：将对数生长期的细胞经0.25％胰蛋白酶消化，用完全培养基终止消化将HepG2.2.15细胞制备成1.5×105个mL密度的细胞悬液，以每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；24h后观察细胞贴壁生长情况良好，弃培养液，加入100μl含药培养基药液终浓度为10、15、20μlml，此浓度根据毒性实验结果确定，以拉米夫定作为阳性对照其浓度为0.1mgml，生理盐水作为阴性对照，每个浓度设3个复孔，培养3天后，分别将每孔的上清液收集置灭菌的EP管中，放置-20℃冰箱中保存备用，再向每孔中加入相应浓度的含药培养液100μL，继续培养6天后，同样收集每孔的上清液于灭菌的EP管中，-20℃保存备用，继续向每孔中加入相应浓度的含药培养液100μl；9天后，收集每孔的细胞上清液置灭菌的EP管中，-80℃保存备用；检测上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平：通过ELISA试剂盒检测上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平；步骤3、实验结果分析：包括对照试剂选择分析、细胞毒性实验分析、药物作用不同时间对细胞抑制率结果分析、G-CQDS对HBsAg、HBeAg抑制作用结果分析、细胞毒性实验分析、倒置显微镜下观察细胞形态分析。

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