申请/专利权人：博生吉医药科技(苏州)有限公司

申请日：2017-08-29

公开（公告）日：2024-02-06

公开（公告）号：CN109422814B

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;C12N5/10;A61K38/17;A61P37/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.06#授权;2020.07.10#实质审查的生效;2019.03.05#公开

摘要：本发明涉及一种抗LaSSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用。具体地，本发明提供了一种抗LaSSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，所述融合蛋白具有优化的式I所示结构：X1‑X2‑L1‑X3‑X4‑X5I，其中各元件如说明书所述。实验结果表明，本发明所提供的经所述融合蛋白修饰的特定NK细胞如LaA‑CAARNK92MI细胞能靶向治疗LaSSB自身抗体阳性的自身免疫性疾病，并且具有疗效好、副作用小、生产成本低等诸多优点。

主权项：1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。

全文数据：一种抗LaSSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用技术领域本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种抗LaSSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用。背景技术自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，其最显著的特点是B细胞过度反应，产生高滴度的自身抗体和全身炎症反应，这些最终导致各种器官的病变。近期，人们越来越意识到B细胞在自身免疫性疾病的发生发展中起到越来越广泛的作用，这为B细胞靶向治疗自身免疫性疾病提供了令人振奋人心的前景。其中CD20靶向的B细胞耗竭实验表明，95％的天疱疮PV病人出现短期的疾病衰退，但是81％的病人复发并出现致命的感染。CD20靶向的B细胞耗竭之后，患者血清中自身抗体滴度明显降低，这预示着在天疱疮疾病中，短寿命的浆细胞是自身抗体的来源，并且靶向CD20阳性的记忆性B细胞前体间接性的杀死了分泌自身抗体的浆细胞。为了能够在治疗天疱疮的同时又不引发广泛的免疫抑制，抗Dsg3B细胞受体作为胞外片段，与相应的信号区域融合，构建的anti-Dsg3CAAR-T在天疱疮小鼠模型中取得了较好的实验结果。然而，一些其它的自身免疫性疾病如红斑狼疮的病因非常复杂，并且自身免疫性疾病患者本身的免疫系统是紊乱的，T细胞功能异常，Th细胞控制耐受，B细胞过度反应，自身免疫潜能细胞PAL大多处于未活化或者活性封闭状态。所以自体性嵌合体抗原受体CART细胞治疗困难重重，达不到理想的状态，而异体性CAR-T细胞移植存在移植物抗宿主反应的风险。因此，本领域迫切需要探索靶向治疗自身免疫性疾病的新策略，能在治疗自身免疫疾病的同时不引发广泛的免疫抑制、移植物抗宿主反应风险小、生产成本低。发明内容本发明的目的是提供一种抗LaSSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，能靶向治疗自身免疫疾病，同时不引发广泛的免疫抑制、移植物抗宿主反应风险小、生产成本低。本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所述结构：X1-X2-L1-X3-X4-X5I，其中，X1为无或信号肽序列；X2为LaA肽；L1为无或连接肽序列；X3为跨膜结构域；X4为共刺激元件；X5为胞浆信号传导序列CD3ζ；“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。在另一优选例中，X3为CD28的跨膜结构域。在另一优选例中，X4选自下组：共刺激元件4-1BB、共刺激元件CD28、或其组合。在另一优选例中，X3和X4共同由含跨膜结构域的CD28和4-1BB构成。在另一优选例中，L1为Fc元件。在另一优选例中，所述Fc元件为哺乳动物免疫球蛋白的Fc元件，优选为人的免疫球蛋白的Fc元件。在另一优选例中，所述Fc元件为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的Fc元件，优选地，Fc元件为IgG的Fc元件，更优选地，Fc元件为IgG1或IgG2的Fc元件。在另一优选例中，所述Fc元件的长度为200-250个氨基酸，较佳地220-240个氨基酸，更佳地约230个氨基酸。在另一优选例中，所述Fc元件具有如SEQIDNO.:1中第130-359位所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述Fc元件的氨基酸序列如SEQIDNO.:1中第130-359位所示。在另一优选例中，所述多肽元件X1选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X2选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件L1选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X3选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X4选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X3和X4共同由SEQIDNO.:1中第360-469位所示的氨基酸序列构成。在另一优选例中，所述多肽元件X3和X4共同具有与SEQIDNO.:1中第360-469位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的氨基酸序列。在另一优选例中，所述多肽元件X3和X4共同为将SEQIDNO.:1中第360-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X5选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述融合蛋白为重组蛋白。在另一优选例中，所述融合蛋白能与LaA-BCR蛋白特异性结合。在另一优选例中，所述融合蛋白能与抗LaSSB抗体特异性结合。本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：a编码如SEQIDNO.:1所示多肽的多核苷酸；b序列如SEQIDNO.:2所示的多核苷酸；c核苷酸序列与b所示序列的同源性≥75％较佳地≥80％的多核苷酸；d如b所示多核苷酸的5’端和或3’端截短或添加1-60个较佳地1-30，更佳地1-10个核苷酸的多核苷酸；e与a-d任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQIDNO.:2所示。本发明的第三方面，提供一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-CopPuro质粒为骨架。在另一优选例中，所述载体是病毒载体。在另一优选例中，所述载体是慢病毒载体。本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本发明第一方面所述的融合蛋白；和或所述宿主细胞基因组中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸；和或所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体。在另一优选例中，所述的细胞为原核细胞或真核细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞是人细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞是NK细胞、T细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞是NK92细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞是NK92MI细胞。本发明的第五方面，提供一种基因工程化的NK细胞，所述NK细胞为哺乳动物的NK细胞，并且所述的NK细胞的细胞膜上表达有本发明第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述NK细胞是离体。在另一优选例中，所述NK细胞是自体或异体的。在另一优选例中，所述NK细胞来自灵长目动物。在另一优选例中，所述NK细胞是人细胞。在另一优选例中，所述NK细胞是NK92细胞。在另一优选例中，所述NK细胞是NK92MI细胞。本发明的第六方面，提供一种药物组合物，所述组合物包含：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述载体或本发明第五方面所述NK细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述药物组合物是液态制剂。在另一优选例中，所述药物组合物是注射剂。在另一优选例中，所述的药物组合物中所述NK细胞的浓度为1×105－1×108个细胞ml，较佳地1×106－1×107个细胞ml。本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述载体、或本发明第五方面所述的NK细胞的用途，用于制备治疗自身免疫疾病的药物或制剂。在另一优选例中，所述自身免疫疾病为与LaSSB自体抗体阳性相关的自身免疫疾病。在另一优选例中，所述自身免疫疾病选自下组：系统性红斑狼疮、干燥综合征。本发明的第七方面，提供一种制备本发明第五方面所述的NK细胞的方法，所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了LaA-BCR蛋白的纯化及其与LaA抗原的亲和力测定。其中，图1A为LaA-BCR-pfuse-hIgG1-FC真核表达载体；图1B为LaA-pET28a+原核表达载体；图1C为纯化后的LaA的SDS-PAGE电泳图；图1D为纯化后的LaA-BCR的SDS-PAGE电泳图；图1E为LaA-BCR与LaA蛋白亲和力的Western印迹分析；图1F为LaA-BCR对LaA肽的ELISA分析。图2显示了LaA-CAARNK92MI细胞的结构特点及其功能性验证。图2A为LaA-CAAR的结构示意图；图2B为LaA-CAAR慢病毒稳定转染NK92MI细胞后，western印迹检测LaA-CAAR在NK92MI细胞中的表达情况；图2C为流式细胞术检测LaA-CAAR在NK92MI细胞中的表达情况；图2D为稳定转染LaA-CAAR结构的NK92MI细胞的平均荧光强度分析。图3显示了LaA-BCR-Jurkat、LaA-BCR-Romas及LaA-BCR-Maver-1细胞功能性验证。图3A为LaA-BCR的结构示意图；图3B为流式细胞术检测LaA-BCR分别在Jurkat、Romas及Maver-1细胞上的表达情况；图3C,D,E分别为稳定转染LaA-BCR结构的Jurkat、Romas及Maver-1细胞的平均荧光强度分析。图4显示了流式细胞仪分析CD19和CD56在NK92MI、LaA-CAARNK92MI、Romas、LaA-BCR-Romas、Maver-1、LaA-BCR-Maver-1及CD3和CD56在Jurkat、LaA-BCR-Jurkat细胞中的表达情况。图5显示了LaA-CAAR-NK92MI细胞可以特异性消除LaA-BCR稳定表达的淋巴瘤细胞系。图5A,C显示了在E:T＝1:1的时候NK92MI及LaA-CAARNK92MI对Romas及LaA-BCR-Romas细胞的毒性作用；图5B,D显示了E:T＝2:1的时候NK92MI及LaA-CAARNK92MI对Romas及LaA-BCR-Romas细胞的毒性作用；图5E,G显示了在E:T＝1:1的时候NK92MI及LaA-CAARNK92MI对Maver-1及LaA-BCR-Maver-1细胞的毒性作用；图5F,H显示了E:T＝2:1的时候NK92MI及LaA-CAARNK92MI对Maver-1及LaA-BCR-Maver-1细胞的毒性作用。图6显示了LaA-CAAR-NK92MI细胞可以特异性消除LaA-BCR稳定表达的T细胞急性淋巴细胞白血病细胞。图6A,C显示了在E:T＝1:1的时候NK92MI及LaA-CAARNK92MI对Jurkat及LaA-BCR-Jurkat细胞的毒性作用；图6B,D显示了E:T＝2:1的时候NK92MI及LaA-CAARNK92MI对Jurkat及LaA-BCR-Jurkat细胞的毒性作用。图7显示了NK92MI细胞对LaA-BCR-Jurkat、LaA-BCR-Romas及LaA-BCR-Maver-1细胞的增殖反应。图A,B显示了Jurkat、LaA-BCR-Jurkat细胞不能刺激NK92MI及LaA-CAAR-NK92MI细胞的增殖；图C,D显示了Romas、LaA-BCR-Romas细胞不能刺激NK92MI及LaA-CAAR-NK92MI细胞的增殖；图E,F显示了Maver-1、LaA-BCR-Maver-1细胞不能刺激NK92MI及LaA-CAAR-NK92MI细胞的增殖。图8显示了流式细胞术检测了LaA-BCR在自身免疫性疾病病人血液B细胞中的表达情况。图9显示了自身免疫性疾病病人样本全血B细胞缺失实验。图A显示了全血B细胞缺失实验流程；图B显示了NK92MI及LaA-CAARNK92MI细胞对自身免疫性病人的T细胞没有杀伤作用；图C显示了NK92MI对自身免疫性病人的B细胞没有杀伤作用；图D显示了LaA-CAARNK92MI细胞对自身免疫性疾病病人的B细胞具有靶向杀伤作用。图10显示了NK92MI及LaA-CAARNK92MI细胞对正常健康人的T及B细胞没有杀伤作用。图A显示了流式细胞技术分析了健康人全血与NK92MI及LaA-CAARNK92MI细胞共孵育24h后，检测T及B细胞的存活比率；图B显示了NK92MI及LaA-CAARNK92MI细胞对正常的T细胞没有杀伤作用；图C显示了NK92MI及LaA-CAARNK92MI细胞对正常的B细胞没有杀伤作用。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种抗LaSSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，所述融合蛋白具有优化的式I所示结构。实验结果表明，本发明所提供的经所述融合蛋白修饰的特定NK细胞如LaA-CAARNK92MI细胞能靶向治疗LaSSB自身抗体阳性的自身免疫性疾病，并且具有疗效好、副作用小、生产成本低等诸多优点。在此基础上完成了本发明。在自身抗体LaSSB强阳性的自身免疫性疾病中，过度反应及致病性的记忆性B细胞表面表达抗LaSSBB细胞受体。因此，本发明将LaSSB作为嵌合体免疫受体的胞外区域，以NK细胞作为效应细胞，细胞毒性靶向于特异性表达抗LaSSBB细胞受体的B细胞LaSSB-BCR-B，而不会抑制整个机体的免疫系统，避免了一系列的副反应，从而为靶向治疗LaSSB自身抗体强阳性的自身免疫疾病提供了强有力的手段。此靶向治疗策略在直接消除膜表面表达抗LaSSBB细胞受体的过度反应B细胞和记忆性B细胞的同时，也间接的消除了分泌致病性LaSSB自身抗体的短寿命的浆细胞。在本发明中，针对抗LaA的B细胞特异性受体LaA-BCR为靶点，嵌合体抗原基因修饰的NK细胞靶向治疗LaSSB自身抗体阳性的自身免疫性疾病，将NK细胞与B细胞特异性受体结合起来，为探索靶向治疗自身免疫性疾病提供一个新的策略，为临床应用CAR-NK治疗自身免疫疾病提供了新的有效方法和制剂。术语LaSSBLaSSB基因是一种管家基因，在细胞核内表达，在一些物理及化学因素的作用下，LaSSB抗原释放并被B细胞识别，从而产生高滴度的针对LaSSB自身抗原的抗体，这些抗体沉积在机体血管及器官各处，从而引起机体的损害。LaSSB自身抗原共分为三个免疫区域：LaA1-107aa，LaC111-242aa和LaL23346-408aa。针对保守翼型螺旋决定簇LaA的自身抗体具有重大的意义，它们几乎百分之百出现在沉淀素阳性的血清中，并且出现在抗LaSSB自身抗体的早期，在自身免疫疾病出现之前具有一定的诊断作用。另外，LaSSB自身抗原被激活后，其特异性的B细胞抗原表位只在过度反应的B细胞和记忆性B细胞上表达，从而避免了脱靶毒性的可能性。LaALaA区域是LaSSB最主要的功能性区域。本发明将LaA抗原区域作为胞外片段，后面连接一系列的功能区域FC，CD28，4-1BB及CD3ζ，构建具有特异性识别致病B细胞的结构CAAR，最后将此结构构建在NK92MI细胞上，从而获得了具有靶向致病性B细胞LaA-BCR-B细胞的LaA-CAARNK92MI效应细胞。LaSSB抗体针对LaSSB的自身抗体在一些自身免疫性疾病的血清中高滴度存在，尤其在系统性红斑狼疮SLE和干燥综合征SS等病人的血清中，是SS诊断标记性抗体，LaSSB抗体阳性病人97％表现为干燥综合征。研究表明，抗LaSSB抗体产生早于SLE症状的出现和诊断，同时也是SLE发病过程中的重要参与者。靶向消除抗LaSSB过度反应的B细胞和记忆性B细胞应该能够治疗及缓解LaSSB自身抗体强阳性的自身免疫性疾病的症状，同时也不存在机体被免疫抑制的风险。NK细胞自然杀伤NK细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。在自身免疫性疾病中，NK细胞失衡减少是导致自身免疫病发病的重要机制，NK细胞减少导致其非特异性抑制B细胞分泌抗体的功能降低。而NK92细胞是目前唯一被FDA批准临床试验的细胞系，细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者并没有对NK92-MI细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险。在本发明中，选择NK细胞作为效应细胞。NK92MI细胞通过基因修饰的NK92MICAAR-NK92MI细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。NK92MI细胞对各种各样的肿瘤都具有很强的细胞毒作用，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及一些实体肿瘤。一些临床试验表明高剂量的NK92MI细胞输入也具有很大的安全性。与自体CAR-T细胞相比，CAAR-NK92MI还具有一下优点，例如：1通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；2它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；3体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似，CAR-NK92或者CAR-NK92MI不会引起免疫耐受。Fc片段如本文所用，术语“Fc片段”、“Fc元件”具有相同的含义，没有特别的限制，是本发明融合蛋白的连接肽片段或绞链域。在本发明中，Fc片段可以是哺乳动物免疫球蛋白的Fc片段，优选为人的免疫球蛋白的Fc片段。在优选例中，Fc片段为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的Fc片段，优选地，Fc片段为IgG的Fc片段，更优选地，Fc片段为IgG1或IgG2的Fc片段。Fc片段的长度为200-250个氨基酸，较佳地220-240个氨基酸，更佳地约230个氨基酸。在本发明的优选例中，Fc片段具有如SEQIDNO.:1中第130-359位所示的氨基酸序列。在另一优选例中，Fc片段的氨基酸序列如SEQIDNO.:1中第130-359位所示。融合蛋白如本文所用，术语“LaA-CAAR”、“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、“活性多肽”和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有本发明第一方面所述的结构。本发明融合蛋白包括：前导序列、能够与LaA-BCR特异性结合的LaA肽、铰链域Fc、CD28跨膜结构域TM、两个共刺激结构域CD28和4-1BB和CD3ζ等一系列的信号区域，将此结构定义为LaA-CAAR。本发明的所述融合蛋白具有以下特点：a本发明融合蛋白表达后，会穿过细胞膜并定位在细胞膜上，形成一个将LaA元件暴露在胞外的膜蛋白。此外，本发明融合蛋白还具有位于胞内的共刺激分子或元件和CD3ζ。此外，本发明融合蛋白还可含有任选的信号肽、连接肽元件linker、或其他元件。b本发明融合蛋白能够非常有效结合于自身免疫性疾病患者如人中B细胞或其他细胞如T细胞表面上的LaA-BCR或LaA-TCR蛋白。c本发明融合蛋白能够有效地中和、抑制和清除自身免疫性疾病患者中的抗LaSSB抗体。如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQIDNO:1序列的变异形式。这些变异形式包括但并不限于：1-3个通常为1-2个，更佳地1个氨基酸的缺失、插入和或取代，以及在C末端和或N末端添加或缺失一个或数个通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽如环肽。本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是i有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基优选保守性氨基酸残基被取代的多肽，或ii在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或iii抗原肽与另一个化合物比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇融合所形成的多肽，或iv附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指与式Ia或式Ib的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。表A最初的残基代表性的取代优选的取代AlaAVal；Leu；IleValArgRLys；Gln；AsnLysAsnNGln；His；Lys；ArgGlnAspDGluGluCysCSerSerGlnQAsnAsnGluEAspAspGlyGPro；AlaAlaHisHAsn；Gln；Lys；ArgArgIleILeu；Val；Met；Ala；PheLeuLeuLIle；Val；Met；Ala；PheIleLysKArg；Gln；AsnArgMetMLeu；Phe；IleLeuPheFLeu；Val；Ile；Ala；TyrLeuProPAlaAlaSerSThrThrThrTSerSerTrpWTyr；PheTyrTyrYTrp；Phe；Thr；SerPheValVIle；Leu；Met；Phe；AlaLeu本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQIDNO.:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基如D-氨基酸的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸如β、γ-氨基酸的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰通常不改变一级结构形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPMAENGDNEKMAALEAKICHQIEYYFGDFNLPRDKFLKEQIKLDEGWVPLEIMIKFNRLNRLTTDFNVIVEALSKSKAELMEISEDKTKIRRSPSKPLPEVTDEYKNDESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSEQIDNo.:1。其中，在SEQIDNo.:1中第1-22位为信号肽；第23－129位为LaA肽；第130－359位为连接肽Fc；第360－427位为跨膜结构域CD28；第428－469位为共刺激元件4-1BB；第470－581位为CD3ζ。编码序列本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQIDNO.:1所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO.:1所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。在本发明较佳的实施方式中，所述多核苷酸的的序列如SEQIDNO.:2所示。本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽或其片段，或其衍生物的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子或如载体和细胞中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来如果是天然的物质，原始环境即是天然环境。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQIDNO.:2所示。ATGCTGCTCCTGGTGACCTCCCTGCTGCTGTGTGAACTCCCCCACCCCGCTTTCCTGCTGATCCCCATGGCTGAAAATGGTGATAATGAAAAGATGGCTGCCCTGGAGGCCAAAATCTGTCATCAAATTGAGTATTATTTTGGCGACTTCAATTTGCCACGGGACAAGTTTCTAAAGGAACAGATAAAACTGGATGAAGGCTGGGTACCTTTGGAGATAATGATAAAATTCAACAGGTTGAACCGTCTAACAACAGACTTTAATGTAATTGTGGAAGCATTGAGCAAATCCAAGGCAGAACTCATGGAAATCAGTGAAGATAAAACTAAAATCAGAAGGTCTCCAAGCAAACCCCTACCTGAAGTGACTGATGAGTATAAAAATGATGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAGATGTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGTGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAGGAGCAAGCGGAGCAGAGGCGGCCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGACTTCGCCGCCTACCGGAGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGGGTGAAGTTCAGCCGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGAGAAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGASEQIDNo.:2。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。应用PCR技术扩增DNARNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNARNA片段。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白GFP，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法如温度转换或化学诱导诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理盐析方法、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析HPLC和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。制备方法本发明的融合蛋白多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。本发明采用常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的融合蛋白。本发明提供了一种制备LaA-CAARNK细胞的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸或载体转导入NK细胞内，从而获得所述LaA-CAARNK细胞。一般来说有以下步骤：1.用编码本发明融合蛋白的多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；2.在合适的培养基中培养的宿主细胞。药物组合物和施用方法本发明LaA-CAARNK细胞可以靶向消除具有LaA特异性BCR的致病性B细胞记忆性B细胞，间接性的抑制了浆细胞分泌抗LaSSB自身抗体，从而实现治疗效果。另一方面，本发明还提供了一种药物包括疫苗组合物，它含有a安全有效量的本发明LaA-CAARNK细胞；以及b药学上可接受的载体或赋形剂。本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的LaA-CAARNK细胞。本发明所述的“活性成分”和药物组合物可用于治疗自身免疫疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分剂，更佳地，含有10-200mg活性成分剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片或一支注射针剂。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等、明胶、滑石、固体润滑剂如硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙、植物油如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等、多元醇如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等、乳化剂润湿剂如十二烷基硫酸钠、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但不限于：口服、瘤内、直肠、肠胃外静脉内、肌肉内或皮下等。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂或载体混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分一种或多种混合：a填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c保湿剂，例如，甘油；d崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；e缓溶剂，例如石蜡；f吸收加速剂，例如，季胺化合物；g润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h吸附剂，例如，高岭土；和或i润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物，较佳地为注射剂或液体制剂。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物如人，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明药物组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药如配制在同一药物组合物中。本发明药物组合物也可以与已知的治疗或改进相似病状的其它药物联用。联合给药时，原来药物的给药方式和剂量保持不变，而同时或随后服用本发明药物组合物。药物联用也包括在重叠的时间段服用本发明药物组合物与其它一种或几种已知药物。当本发明药物组合物与其它一种或几种药物进行药物联用时，本发明药物组合物或已知药物的剂量可能比它们单独用药时的剂量较低。本发明的主要优点1本发明提供的LaA-CAARNK92MI能够特异性的杀伤表达LaA-BCR的致病性B细胞记忆性B细胞，间接的杀死分泌抗LaA自身抗体的浆细胞，从而减轻自体抗体对机体的破坏，缓解自身免疫性疾病的症状，同时不引发广泛的免疫抑制，对正常的T细胞和B细胞没有明显的杀伤作用，不影响机体的正常免疫功能，无副反应。2本发明提供的LaA-CAARNK细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，生产成本低，没有移植物抗宿主反应的危险。3本发明提供的LaA-CAARNK细胞对LaA-BCR-Jurkat同样具有很强的细胞溶解作用，为将来进一步探索CAAR-NK细胞特异性杀伤自身反应性T细胞淋巴细胞提供了研究基础。4LaSSB自身抗原被激活后，其特异性的B细胞抗原表位只在过度反应的B细胞和记忆性B细胞上表达，因此本发明提供的LaA-CAARNK92MI在靶向治疗时，脱靶毒性的可能性低。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。通用方法1.细胞系及血液样本人T细胞性急性淋巴母细胞白血病Jurkat细胞与人淋巴瘤细胞株Maver-1和Romas细胞应用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。HEK293T细胞应用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养。NK92MI是一株IL-2非依赖的自然杀伤细胞系，来源于通过稳定转染的方法把IL-2稳定表达在NK92细胞系。应用含有0.2mM的肌醇、0.1mM的β-巯基乙醇、0.02mM叶酸及12.5％马血清的MEM-α培养基培养。这些细胞系均来自于ATCC，培养基中添加100Uml的青霉素和100μgml的链霉素，37度含有5％CO2的培养箱中培养。LaSSB自体抗体强阳性的病人及健康人血液样本在经过本人同意参与该研究之后采集，也通过了苏州大学伦理委员会的同意。2.统计分析统计分析由GraphPadPrism软件版本5.0来完成的。Paired-T检验用来比较组间差异，P博生吉医药科技（苏州）有限公司一种抗LaSSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用P2017-12272PatentInversion3.51581PRT人工序列artificialsequence1MetLeuLeuLeuValThrSerLeuLeuLeuCysGluLeuProHisPro151015AlaPheLeuLeuIleProMetAlaGluAsnGlyAspAsnGluLysMet202530AlaAlaLeuGluAlaLysIleCysHisGlnIleGluTyrTyrPheGly354045AspPheAsnLeuProArgAspLysPheLeuLysGluGlnIleLysLeu505560AspGluGlyTrpValProLeuGluIleMetIleLysPheAsnArgLeu65707580AsnArgLeuThrThrAspPheAsnValIleValGluAlaLeuSerLys859095SerLysAlaGluLeuMetGluIleSerGluAspLysThrLysIleArg100105110ArgSerProSerLysProLeuProGluValThrAspGluTyrLysAsn115120125AspGluSerLysTyrGlyProProCysProProCysProAlaProGlu130135140PheLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp145150155160ThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAsp165170175ValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGly180185190ValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsn195200205SerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp210215220LeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysGlyLeuPro225230235240SerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu245250255ProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGluGluMetThrLysAsn260265270GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle275280285AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr290295300ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerArg305310315320LeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGluGlyAsnValPheSerCys325330335SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeu340345350SerLeuSerLeuGlyLysMetPheTrpValLeuValValValGlyGly355360365ValLeuAlaCysTyrSerLeuLeuValThrValAlaPheIleIlePhe370375380TrpValArgSerLysArgSerArgGlyGlyHisSerAspTyrMetAsn385390395400MetThrProArgArgProGlyProThrArgLysHisTyrGlnProTyr405410415AlaProProArgAspPheAlaAlaTyrArgSerLysArgGlyArgLys420425430LysLeuLeuTyrIlePheLysGlnProPheMetArgProValGlnThr435440445ThrGlnGluGluAspGlyCysSerCysArgPheProGluGluGluGlu450455460GlyGlyCysGluLeuArgValLysPheSerArgSerAlaAspAlaPro465470475480AlaTyrGlnGlnGlyGlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGly485490495ArgArgGluGluTyrAspValLeuAspLysArgArgGlyArgAspPro500505510GluMetGlyGlyLysProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyr515520525AsnGluLeuGlnLysAspLysMetAlaGluAlaTyrSerGluIleGly530535540MetLysGlyGluArgArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGln545550555560GlyLeuSerThrAlaThrLysAspThrTyrAspAlaLeuHisMetGln565570575AlaLeuProProArg58021746DNA人工序列artificialsequence2atgctgctcctggtgacctccctgctgctgtgtgaactcccccaccccgctttcctgctg60atccccatggctgaaaatggtgataatgaaaagatggctgccctggaggccaaaatctgt120catcaaattgagtattattttggcgacttcaatttgccacgggacaagtttctaaaggaa180cagataaaactggatgaaggctgggtacctttggagataatgataaaattcaacaggttg240aaccgtctaacaacagactttaatgtaattgtggaagcattgagcaaatccaaggcagaa300ctcatggaaatcagtgaagataaaactaaaatcagaaggtctccaagcaaacccctacct360gaagtgactgatgagtataaaaatgatgagagcaagtacggccctccctgccccccttgc420cctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggac480accctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggag540gaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagacc600aagccccgggaggagcagttcaatagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctg660caccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaagggcctgccc720agcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggagccccaggtgtac780accctgccccctagccaagaggagatgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctggtg840aagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaac900aactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcagg960ctgaccgtggacaagagccggtggcaggagggcaacgtctttagctgctccgtgatgcac1020gaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgtccctgagcctgggcaagatgttc1080tgggtgctggtcgtggtgggtggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggcc1140ttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagaggcggccacagcgactacatgaac1200atgaccccccggaggcctggccccacccggaagcactaccagccctacgcccctcccagg1260gacttcgccgcctaccggagcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaa1320ccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttcca1380gaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagccggagcgccgacgcccct1440gcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggccggagggaggag1500tacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagccccggaga1560aagaaccctcaggagggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctac1620agcgagatcggcatgaagggcgagcggcggaggggcaagggccacgacggcctgtaccag1680ggcctgagcaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccc1740agatga1746

权利要求：1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所述结构：X1-X2-L1-X3-X4-X5I，其中，X1为无或信号肽序列；X2为LaA肽；L1为无或连接肽序列；X3为跨膜结构域；X4为共刺激元件；X5为胞浆信号传导序列CD3ζ；“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽元件X1选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和或所述多肽元件X2选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和或所述多肽元件L1选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和或所述多肽元件X3选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和或所述多肽元件X4选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和或所述多肽元件X5选自下组：A具有SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列的多肽；B具有与SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列≥80％同源性优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性的多肽；C将SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4所述的多核苷酸。6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白；和或所述宿主细胞基因组中整合有外源的权利要求4所述的多核苷酸；和或所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体。7.一种基因工程化的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞为哺乳动物的NK细胞，并且所述的NK细胞的细胞膜上表达有权利要求1所述的融合蛋白。8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：权利要求1所述的融合蛋白、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述载体或权利要求7所述NK细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。9.权利要求1所述的融合蛋白、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述载体、或权利要求7所述的NK细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗自身免疫疾病的药物或制剂。10.一种制备权利要求7所述的NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

百度查询： 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用

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