申请/专利权人：沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司;沈阳汇智细胞产业技术创新研究院有限公司

申请日：2023-12-13

公开（公告）日：2024-03-08

公开（公告）号：CN117660306A

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.03.26#实质审查的生效;2024.03.08#公开

摘要：本发明公开了一种角质形成细胞的培养方法，包括以下步骤：（一）原代角质形成细胞的分离：取人体皮肤组织，清洗，剪碎，依次加入消化液、胰酶、DNA酶进行消化；100μm细胞过滤器过滤，离心得细胞沉淀，重悬于接种培养基中培养，然后通过胰酶消化时间差分离出成纤维细胞与角质形成细胞；（二）角质形成细胞的三维培养：将角质形成细胞重悬于接种培养基中，培养3天；换液为角质形成细胞培养液，培养7天。本发明的方法不需要先分离两层组织，避免了长时间消化和复杂的实验操作；能促进细胞增殖，使细胞快速粘附增长，干表皮性均一，提高角质细胞增殖和迁移率。本发明的角质形成细胞的培养方法对角质形成细胞的培养具有重要意义。

主权项：1.一种角质形成细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）原代角质形成细胞的分离（1）取人体皮肤组织，清洗，剪碎得组织匀浆；（2）加入消化液，消化25～35分钟；（3）加入胰酶，消化8～12分钟；（4）加入DNA酶，消化4～6分钟；（5）停止消化，吹打混匀以充分释放细胞；（6）100μm细胞过滤器过滤，以去除组织碎片，上清液离心，得细胞沉淀；（7）将细胞沉淀重悬于接种培养基中培养培养；（8）待原代细胞培养至融合率85%～90%时，弃掉培养基，加入胰酶，消化30秒，离心，获得成纤维细胞；向上清液中再次加入胰酶，消化5分钟，离心，获得角质形成细胞；（二）角质形成细胞的三维培养（9）将上述获得的角质形成细胞重悬于接种培养基，平铺于预包被的培养板上，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养3天；（10）换液，将接种培养基换成角质形成细胞培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养7天；所述角质形成细胞培养液的组分组成为：青霉素，80～120Uml；链霉素，0.08～0.12mgml；FGF-2，75～85ngmL；EGF，45～55ngmL；B27无血清添加剂，1.8%～2.2%；氢化可的松，0.8～1.2μM；孕酮，15～25nM；转铁蛋白，8～12μgμl；腺嘌呤，35～45μM；脐带间充质干细胞条件培养基，0～8%；余量为细胞培养基。

全文数据：

权利要求：

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