申请/专利权人：上海兴瑞一达生物科技有限公司

申请日：2023-11-28

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN117305241B

主分类号：C12N5/0783

分类号：C12N5/0783;C12N5/0789;C12N5/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2024.01.16#实质审查的生效;2023.12.29#公开

摘要：本发明提供一种hiPSCs诱导分化为NK细胞的方法，所述方法包括hiPSCs诱导分化为拟胚体细胞、拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞、中胚层细胞诱导分化为CD34+造血干细胞、CD34+造血干细胞诱导分化为NK细胞、NK细胞的扩增培养；所述hiPSCs诱导分化为拟胚体细胞步骤中，采用的培养基为DMEMF‑12培养基中添加终浓度为10μM的Y‑27632、10μM的SB431542、50ngmL的VEGF、10ngmL的IGF1、100ngmL的L‑抗坏血酸。本发明CD34+造血干细胞和NK细胞的诱导率均较高，本发明得到的NK细胞对靶细胞具有更高的体外杀伤率。

主权项：1.一种hiPSCs诱导分化为NK细胞的方法，其特征在于：所述方法包括hiPSCs诱导分化为拟胚体细胞、拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞、中胚层细胞诱导分化为CD34+造血干细胞、CD34+造血干细胞诱导分化为NK细胞、NK细胞的扩增培养；所述hiPSCs诱导分化为拟胚体细胞的方法为用诱导培养基一将hiPSCs细胞吹散接种，记为day0，培养，在day1收集形成的拟胚体细胞；所述诱导培养基一为DMEMF-12培养基中添加终浓度为10μM的Y-27632、10μM的SB431542、50ngmL的VEGF、10ngmL的IGF1、100ngmL的L-抗坏血酸；所述拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞的方法为，将离心后的拟胚体细胞，加入含有细胞因子的无血清分化培养基中培养，培养2天后更换新鲜的含有细胞因子的无血清分化培养基，继续诱导2天得到中胚层细胞；所述含有细胞因子的无血清分化培养基为无血清分化培养基中添加终浓度为25ngmL的BMP4、50ngmL的VEGF、50ngmL的FGF2、10μM的CHIR99021、10μM的SB431542；所述中胚层细胞诱导分化为CD34+造血干细胞的方法为，将诱导得到的中胚层细胞离心，弃上清，加入含有细胞因子和化学小分子的无血清分化培养基培养，培养3天得到CD34+造血干细胞；所述含有细胞因子和化学小分子的无血清分化培养基为无血清分化培养基中添加终浓度为25ngmL的BMP4、30ngmL的SCF、50ngmL的TPO、20ngmL的FLT-3L、20ngmL的IL-6、20ngmL的IL-7、25μM的噻唑烷、50ngmL的LIF；所述CD34+造血干细胞诱导分化为NK细胞的方法为，收集诱导获得的CD34+造血干细胞，接种后，加入含有因子的NK细胞分化培养基，培养2周，每三天进行半量更换含有因子的NK细胞分化培养基，分化完成后收集细胞获得总分化细胞，即NK细胞；所述含有因子的NK细胞分化培养基为NK细胞分化培养基中添加终浓度为50ngmL的SCF、30ngmL的TPO、50ngmL的FLT-3L、30ngmL的IL-2、20ngmL的IL-6、20ngmL的IL-15；所述NK细胞的扩增培养方法为将收集的NK细胞，离心去除NK细胞分化培养基，接种于含有添加剂的NK细胞扩增培养基中，培养2周，每三天进行半量更换含有添加剂的NK细胞扩增培养基，收集扩增后的NK细胞；所述含有添加剂的NK细胞扩增培养基为NK细胞扩增培养基中添加终浓度均为20ngmL的IL-2、IL-6、IL-12、IL-18因子外，另外添加终浓度为5μM的鹰爪豆碱；所述无血清分化培养基为DMEMF-12培养基中，添加终浓度为100μgmL的聚乙烯醇、100μM的硫代甘油、20μM的乙醇胺、100μgmL的r-HSA、125μM的L-抗坏血酸、0.25μM的亚油酸、10ngmL的IGF1、100ngmL的肝素；所述NK细胞分化培养基为50%Vol的IMEM和50%的F-12培养基混合而成，含有1%Vol谷氨酰胺、250μM的抗坏血酸、2mM的烟酰胺；所述NK细胞扩增培养基为50%Vol的IMEM和50%的F-12培养基混合而成，含有1%Vol谷氨酰胺、2mM的烟酰胺、100μgmL的肝素。

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