申请/专利权人：三亚中国农业科学院国家南繁研究院;中国农业科学院棉花研究所

申请日：2023-11-23

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN117286178B

主分类号：C12N15/83

分类号：C12N15/83;C12N15/66;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2024.01.12#实质审查的生效;2023.12.26#公开

摘要：本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用。本发明针对双组份植物病毒载体进行了优化，使双组份的病毒基因组放置在单一质粒中。单一质粒的使用，避免了辅助菌的活化、重悬和混匀过程，简化了农杆菌实验阶段一半的工作量，避免了混菌过程中潜在的交叉污染风险，提高了病毒侵染性，因此极大简化了双组份病毒载体的使用。本发明能够通过串联多个病毒基因组实现更为复杂的基因操纵，因而更适用于构建VIGS突变体库以及基于VIF的大规模材料快速繁种等高通量应用。本发明还为其它双组份病毒载体的从头开发和应用提供了简化模版。

主权项：1.一种双组份病毒载体的简化构建方法，其特征在于，所述简化构建方法包括以下步骤；改造病毒载体骨架和构建双组分病毒的串联质粒；所述改造病毒载体骨架包括以下步骤：分析得到多克隆位点处的酶切位点，将病毒载体骨架中多克隆位点处的酶切位点改造为多克隆位点区的限制性内切酶或外切酶的酶切位点；所述酶切位点的侧翼序列改造为接头序列；所述构建双组分病毒的串联质粒包括以下步骤：将接头序列，通过PCR和同源重组的方式进行串联得到双组份病毒载体的单一质粒；所述接头序列为如SEQIDNO.31和SEQIDNO.32所示的序列；所述双组份病毒载体包括双组份DNA病毒载体或双组份RNA病毒载体；当所述双组份DNA病毒载体为棉花皱叶病毒CLCrV时，所述双组份DNA病毒载体中的两个组分的两侧为各自的CR区，所述CR区可通过任意为酶切位点序列连接，另一端CR区连接质粒的T-DNAborder或其它原核表达组分；所述CR区包括病毒复制时保守的剪接位点；当所述双组份RNA病毒载体为烟草脆裂病毒TRV时，所述双组份RNA病毒载体中的两个组分置于两个表达框中独立表达；所述的表达框为35S表达框，启动子为35S，终止子为NOS。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 三亚中国农业科学院国家南繁研究院;中国农业科学院棉花研究所 一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用

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