申请/专利权人：生物医学网络研究中心(CIBER-ISCIII);因克立瓦基金会;瓦伦西亚大学

申请日：2017-11-06

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN110325861B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68

优先权：["20161104 EP 16382509.4"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2019.11.19#实质审查的生效;2019.10.11#公开

摘要：在基于质谱的方法的基础上，特别是在多反应监测靶向质谱MRM‑MS的基础上，本发明提出了一种检测来自脓毒症或脓毒性休克SS患者的血浆中的循环组蛋白H3和H2B的新方法。这些方法允许使用内标定量组蛋白，并显示出优秀的特异性和灵敏度值。

主权项：1.SEQIDNO1和SEQIDNO2在制备质谱法检测循环组蛋白以确定脓毒症的试剂盒中的用途，其中循环组蛋白H3的浓度相当于存在于胰蛋白酶处理后的生物样品中的肽SEQIDNO1的量，SEQIDNO1为STELLIR，并且循环组蛋白H2B的浓度相当于存在于胰蛋白酶处理后的生物样品中的肽SEQIDNO2的量，SEQIDNO2为LLPGELAK。

全文数据：检测脓毒症或脓毒性休克SS患者血浆中的循环组蛋白H3和H2B的基于质谱的方法技术领域本发明涉及医学领域，尤其涉及通过使用基于质谱的方法在血浆生物标志物检测基础上的疾病诊断预后领域。更具体地，本发明涉及基于质谱的方法，该方法用于检测疑似患有脓毒症或脓毒性休克的血浆患者中的循环组蛋白H3和H2B，以为那些患者进行脓毒症或脓毒性休克的诊断预后。背景技术脓毒症被定义为伴随生化异常和器官功能障碍的对危及生命的严重感染的宿主全身性炎症反应。这是一个重大的医疗保健问题，每年影响着全世界数百万人。由于人口老龄化、免疫衰老以及所导致的免疫力受损，脓毒症的发病率正在增加。此外，脓毒症是大多数重症监护病房ICU中最常见的死亡原因，特别是如果未及时得到识别和治疗。尽管脓毒症在全球范围内具有重要性并被视为公共卫生问题，2011年在美国医院总费用中占有超过200亿美元5.2％，但是公众对脓毒症的认识却是匮乏的。脓毒性休克应定义为脓毒症的子类，在脓毒性休克中，与单独的脓毒症相比，特别严重的循环、细胞和代谢异常与更高的死亡风险相关。脓毒性休克患者可通过以下来临床鉴定：尽管有足够的容量复苏，但是仍然需要血管加压剂来保持平均动脉压为65mmHg或更高以及血清乳酸水平大于2mmolL18mgdL。脓毒症的短期死亡率在10％至40％之间，并且已经被报道为如脓毒性休克那样高达30至60％。尽早给予患者早期目标导向性治疗和适当的抗生素治疗均证明有效降低死亡率，但尽管治疗方法有所改进，但短期死亡率仍然很高。先前已经研究了与脓毒症过程相关的循环组蛋白的存在，并且一些工作显示血浆中特定组蛋白的存在与持久的脓毒症引起的症状之间存在直接相关性。在健康个体的血液中发现低浓度的循环组蛋白，但是循环组蛋白的水平在患有严重创伤、全身性炎症、脓毒症或组织损伤的患者中大大增加。值得注意的是，组蛋白显示出令人感兴趣的细胞毒性潜力，这已被证明会影响细菌和哺乳动物细胞，导致脓毒症恶化进展。然而，对于每种组蛋白类型，与其致病性相关的具体浓度水平尚未达成明确的共识。此外，具体的组蛋白水平及其用于监测脓毒症进展的能力以及其与治疗效果的相关性从未得到充分阐明。这是由于，在绝大多数情况下，缺乏分析循环组蛋白的存在和尤其是定量循环组蛋白水平的特定和敏感的方法。先前已经使用用于检测在血浆中循环的游离组蛋白的免疫测定IA，但是由IA获得的结果显示重现性低，误差范围高并且灵敏度低。此外，半定量IA显示出许多缺陷，例如，测定之间的一致性差，使用来自制造商的使用不同专有抗体的不同试剂盒在每个测定中识别不同表位时重现性差异，以及可变的交叉反应性。此外，在IA中可能发生各种干扰，包括在测验的生物样品中存在的抗试剂抗体和内源性自身抗体，可以产生错误的结果并引起临床副作用。因此，需要通过增加诊断和预后脓毒症生物标志物的检测灵敏度和特异性的其他方法或技术来替换当前的IA。发明内容本发明的作者得出结论，通过用基于质谱法的方法代替现有的IA方法，与脓毒症的诊断和预后相关的生物标志物的检测的灵敏度和特异性得到显著改善。在这方面，在本文中显示使用特异性重标记的heavilylabeledSpike-In肽的靶向质谱MS作为有效且灵敏的血液循环组蛋白鉴定和定量方法。因此，通过使用所述基于质谱的方法，监测脓毒症和或脓毒性休克将因具有高灵敏度和特异性的可负担的新生物标志物而极大地受益。在这个意义上，在本发明中，在基于质谱的方法的基础上，特别是在多反应监测靶向质谱MRM-MS和多反应监测方法的基础上，我们提出了一种检测来自脓毒症或脓毒性休克SS患者的血浆中的循环组蛋白H3和H2B的新方法。这些方法允许使用内标定量组蛋白，并显示出强烈的特异性和灵敏度值。使用来自患者的生物样品，与健康对照相比，我们进一步验证了我们的方法，而且，我们已经能够设定与脓毒性休克患者的致命结果相关的血浆组蛋白水平的阈值。因此，该方法可以设定将基于质谱对组蛋白H3和H2B水平的定量注入存在这些循环组蛋白的病理学中的标准，从而提供监测疾病进展和临床干预的最有价值的工具。附图说明图1.对组蛋白H2B和H3的靶蛋白质MRM-MS定量的概述。肽LLLPGELAK和STELLIR的色谱图示出与转变相对应的信号的积分峰面积重，300fmol和内源。将靶肽的峰面积与用作标准的稳定的Spike-In肽的峰面积进行比较。还示出来源于MSMS谱的序列特异性转变。图2.箱形图显示血浆中检测到的组蛋白H2B和H3的水平。A表示健康对象对比患有菌血症的脓毒性休克患者的H2B和H3水平的箱形图；B表示存活者和未存活者SS患者的H2B和H3水平的箱形图。箱表示四分位数范围，直线表示中位数，而须线whisker表示第10百分位数和第90百分位数。水平表示为血浆中的H2B或H3ngmL。图3.组用于区分SS存活者和SS未存活者患者的蛋白H2B3A和H33B的接受者操作特征ROC曲线。ROC曲线基于H2B和H3水平的MRM-MS定量。图4.ALLLPGELAK和BSTELLIR的总色谱图中观察到的非特异性内源性多反应监测MRM信号。箭头表示分配给目标肽的峰。在两种肽的洗脱时间均未发现干扰峰。图5.来自对照非脓毒性ICU重症监护病房患者和普通健康群体、脓毒症和脓毒性休克患者的血浆中的循环组蛋白H2B的水平。盒须图表示四组中的H2B水平。箱表示四分位数范围，水平线表示中位数，而须线表示第10百分位数和第90百分位数。水平表示为H2BngmL。图6.标准的纯蛋白H3.1中STLLIR在nano-LC-MRM-MS色谱图中的强度图7.标准的纯蛋白H2B中LLLPGELAK在nano-LC-MRM-MS色谱图中的强度。图8.肽LLLPGELAK对组蛋白H2B的响应曲线。轻肽浓度在0.012ugmL至60ugmL之间变化，并测量该轻肽相对于重肽信号的浓度。该图示出不同转变的MS谱面积与肽浓度之间的线性回归。图9.肽STELLIR对H3的响应曲线。轻肽浓度在0.012ugmL至60ugmL之间变化，并测量该轻肽相对于重肽信号的浓度。该图示出不同转变下的MS谱面积与肽浓度之间的线性回归。具体实施方式通过以及时和适当的方式重新定义特定治疗，脓毒症和SS的早期诊断和患者快速分层可以改善患者结果。这对ICU执业医师来说是一个挑战，他们需要新的生物标志物来识别可能向更危重的病理状态发展的患者。脓毒症和SS的病理生理学的复杂性及脓毒症和SS的许多疾病分类学威胁是临床生物标志物及生物学生物标志物均未被证实高度准确地预测不良结果的原因。MRM-MS为生物标志物发现和生物标志物验证提供了潜在的方法。此外，该方法提供了生物标志物临床验证所需的灵敏度、准确度和高通量，因此消除了执行不同的发现和验证方法的必要性。血浆是用于诊断测定的生物标志物的来源，但它也是在蛋白质组学研究中具有挑战性的生物基质，因为这种液体中存在动态广泛的蛋白质1010。已经提出的监测每种肽的单次转变对于复杂混合物如血浆中的肽定量是足够特异的。另一方面，经典生物标志物在预测脓毒症患者的结果方面不会添加比基本评分更多的信息。尽管具有CRP和PCT以补充脓毒症的诊断并且PCT作为预后生物标志物是有用的，但是脓毒症的未来知识需要发现可以为灵敏的、具有特异性的且经济上可负担的新生物标志物。对感染的压倒性免疫反应可以将组蛋白释放到血液中，不仅可以通过称为NETosis的过程来对抗感染，还可以作为内皮损伤和中性粒细胞和其他免疫细胞凋亡的结果。已经描述了所有组蛋白类型的毒性，但是在这方面一些数据存在争议，包括组蛋白类型和血浆浓度。Abrams和合作者对内部接头组蛋白H1和核心H2A、H2B、H3和H4组蛋白获得了类似细胞毒性结果，而其他作者发现H3、H4以及某些情况下的H2B的细胞毒性比H2A更高。此外，组蛋白介导包括胸腺、脾和血液在内的淋巴室中的细胞的凋亡。特别是，已提出H4为驱动淋巴细胞凋亡的主要组蛋白。其他研究已经在脓毒症患者的血浆中鉴定出组蛋白H3和核小体。除组蛋白类型外，IA还提供了在脓毒症中不同水平的循环组蛋白，但之前的研究从未能够提供可被视为具有细胞毒性的严格的浓度范围。为了确定一种灵敏且具有特异性的方法来定量血浆样品中的循环组蛋白，我们开发了一种基于MRM-MS的方法，该方法使用LLLPGELAK和STELLIRSpiked-In肽来分别检测H2B和H3组蛋白。本方法允许鉴定存活者和未存活者中与在ICU中的最初24小时内脓毒症发作具有显著相关系数的患者。两种组蛋白的存在可用于临床目的，从而首次确定血浆组蛋白H2B和H3的特定浓度范围，该特定浓度范围在患者到达ICU时用作第一分类标准，并且还会成为有价值的脓毒性休克致命结果预后生物标志物。为了提供这样的方法并选择存活者和未存活者中与在ICU中的最初24小时内脓毒症发作具有显著相关系数的最佳的肽，我们使用5600TripleTOF质谱仪SCIEX通过纳米LCMSMS-DIA进行对H2B_HUMAN和H3_HUMAN蛋白、纯标准品的分析。这种分析使我们能够通过BLAST鉴定出总共29种用于H2B_HUMAN的胰蛋白酶肽，统计置信度为95％或更高。在H3_HUMAN的情况下，该分析使得我们指定出18种肽，统计置信度为95％或更高。此外，通过使用生物信息学程序MRMPilotSciex和SkylineMacossLab，DepartmentofGenomeSciences，UW，USA，并丢弃那些漏切且氨基酸易于修饰MWQN的肽，适用于下游MRM实验的候选物减少到：在调整诸如“去簇电位DeclusteringPotential”和“碰撞能量”的采集参数的过程中以及在复杂基质中分析标准蛋白质的过程中，确定针对H3.1的最强的肽是STELLIR并且针对H2B的最强的肽是LLLPGELAK，因此，STELLIR和LLLPGELAK被选为用于对循环组蛋白H3和H2B进行定量的MRM-MS实验的候选物。，在图6和7中示出的nanoLC-MRM-MS色谱图中说明了对于每种标准的纯蛋白质的强度差异。为了实现对复杂基质中的肽进行可靠的相对定量，必须对靶向蛋白质组测定在其特异性、线性范围、精确度和可重复性方面进行分析表征。对于血液循环组蛋白的定量，特异性、线性范围、精确度和可重复性是强制性要求，因此，在我们的实验条件下我们检查了肽LLLPGELAK相对组蛋白H2B的线性以及肽STELLIR相对H3的线性。在图8和图9中，我们分别示出了肽LLLPGELAK相对组蛋白H2B的线性以及肽STELLIR相对H3的线性，其中考虑到测试的每种肽浓度的不同转变。结果由此证明每种肽的检测浓度高于测定的定量极限并且在测定的线性范围内。事实上，肽LLLPGELAK相对组蛋白H2B以及肽STELLIR相对H3显示出良好的线性范围、良好的灵敏度和特异性。应注意的是，在本发明的上下文中，“定量极限”被理解为定量的下限，并且是指分析物可以进行定量测量的最低浓度。定量的上限描述了分析物的最高浓度，高于该浓度则信号偏离线性。这两个定量极限定义了测定的线性范围。另外，如实施例中所示，分析了总共17名在入住医疗ICU时被临床诊断为SS的患者。表1示出了患者的临床特征。将来自ICU患者和健康对象的血液样品收集于EDTA管中。将每个样品在室温RT下以2500rpm离心10分钟以分离血浆，然后将等分试样储存在-80℃直至将其用于MRM-MS实验。如本文包括的实施例中所述进行MRM实验。基于针对LLPGELAK和STELLIR肽获得的平均比，评估H2B和H3组蛋白水平。从靶蛋白的相对分子质量Mr值H2B和H3的Mr分别为13.906Da和15.404Da推导出H2B和H3的最终浓度ngmL。对于组蛋白H2B，在对照健康对象中发现平均水平为204.48ngmL95％CI为25.31至283.66，而在患者中平均水平增加至高达1736.91ngmL95％CI为555.34至2918.47。观察到的差异在统计上是显著的p＝0.014，且高于对照的平均水平为23.50ngmL95％CI为3.97至50.98并且患者的平均水平为2040.79ngmL95％CI为756.58至3325.01的组蛋白H3p＝0.004图2A。组蛋白水平与两组中的显著相关系数正相关斯皮尔曼系数r＝0.848，对照组p＝0.002，r＝0.827，患者p10％的那些患者的死亡率为27％，相比之下未进行体液复苏的患者的死亡率为83％，其中对于清除该代谢物的患者，ICU死亡率的优势比OR为0.4IC为0.16-1.06。两个患者组的ICU停留时长与住院时长中位数没有差异。关于ICU停留第一天患者的血液检查结果，两组之间几乎没有差异。炎症参数白细胞计数，C-反应蛋白CRP和降钙素原PCT水平与乳酸的第一水平相当，反映了均一的临床灌注不足。治疗6小时后，观察到乳酸水平显著差异，两组之间凝血酶原时间和动脉氧分压与吸入氧分数PaO2FiO2比再次显示，在未存活者组中情况更糟糕，并且器官功能障碍更晚期。招募了总计10名健康对照，他们比病例更年轻，更合适地，为男性。对照的中位年龄为42岁20至56岁，男性对照占70％。H2B和H3的MRM分析首先，测定组蛋白肽的入选者以选择血液样品中最好的用于Spiked-In制备和随后的MRM-MS测量的肽。在LC-MSMS实验中基于实验观察，选择分别来自对纯化的H2B和H3进行胰蛋白酶消化的肽LLLPGELAK和STELLIR。这是设计MRM分析的关键点，因为来自相同蛋白质的不同肽在其MS响应中可以广泛变化并且可能在血浆样品中产生干扰。我们选择的独特得肽序列显示出良好的色谱参数、最佳电离效率和高MSMS质量，并且显示出对于信号的较大浓度线性数据未显示。两种序列用于使SS患者和健康对象的血浆样品形成尖峰。图1示出具有追踪血浆样品中的H2B和H3的最强如前所定义MRM信号的色谱图。使用ABsciex分析出峰的血浆样品，其中每1μg蛋白质使用300fmolLLLPGELAK和STELLIR，我们能够检测出肽，并且信噪比良好。发现两种肽在洗脱时间的非干扰峰图4。循环组蛋白H2B和H3作为诊断和预后SS的潜在生物标志物对于组蛋白H2B，发现对照中的平均水平为204.48ngmL95％CI为25.31至283.66，而在患者中平均水平增加至高达1736.91ngmL95％CI为555.34至2918.47。观察到的差异在统计学上是显著的p＝0.014，且高于对照的平均水平为23.50ngmL95％CI-3.97至50.98且患者的平均水平为2040.79ngmL95％CI为756.58至3325.01的组蛋白H3p＝0.004图2。组蛋白水平与两组中的显著相关系数正相关斯皮尔曼系数r＝0.848，对照组p＝0.002，r＝0.827，患者p0.0001。对于存活的患者，与未存活者相比，在ICU的最初24小时内两种组蛋白的平均水平显著低图2B，值达到未存活者中检测到的水平的五分之一。对于组蛋白H2B，存活者的平均水平为607.00ngmL95％CI为204.20至1009.82，未存活者的平均水平为3008.05ngmL95％CI为603.94至5412.15p＝0.046，且关于组蛋白H3的水平观察到相同的比例差异，即观察到的存活者的平均值为740.70ngmLCI95％为311.16至1170.23，未存活者的平均值为3503.41ngmLCI95％为955.95至6050.86p＝0.036。MRM-MS法检测组蛋白H2B和H3的特异性和灵敏度进行的用以评估组蛋白H2B和H3水平的诊断能力的ROC曲线分析表明两者都可以作为有价值的区分脓毒性休克病例和健康对照的生物标志物。表2中示出了每种组蛋白的AUCROC曲线下面积、标准误差、置信区间CI、最佳浓度截止值、灵敏度和特异性。虽然两种组蛋白的AUC相似，并且在健康对照和患者之间两种生物标志物的水平显著不同，但组蛋白H3显示出诊断灵敏度和特异性值更高。对于该生物标志物，以浓度为83.36ngmL作为最佳截止值，该方法的灵敏度和特异性值分别为94.1％和90.0％。循环H2B和H3及其对患者早期结果的潜力为了检查血浆中的组蛋白作为脓毒性休克预后的生物标志物的潜在用途，我们为每种组蛋白建立了相应的ROC曲线。我们只选择了病例并计算了生物标志物参数：最佳截止值、灵敏度和特异性，以辨别存活者和未存活者图3。同样，组蛋白H3比组蛋白H2B更好地分类以用于预后。相比组蛋白H2B灵敏度＝62.5％，特异性＝88.9％，截止值＝1426.38ngmL，组蛋白H3的灵敏度值灵敏度＝75.0％，特异性＝88.9％，截止值＝1348.13ngmL更高，并且截止值相似。实施例2.区别化诊断分析了总计40个样品，研究中包括以下组间分布：在ICU选择的没有感染性病状的11个对照非脓毒性ICU对照患者，选自普通健康群体的11个对照，8个脓毒症病例和10个脓毒性休克病例。对于组蛋白H2B，在40份血浆中发现的平均水平如下表2：组[H2B]ngmLCI95％ICU对照群体132.6392.68-172.59普通对照群体108.8784.23-133.50脓毒症219.63162.05-277.21脓毒性休克1305.32587.42-2023.23图5中示出了结果，其中示出了来自对照ICU和普通群体、脓毒症和脓毒性休克患者的血浆中循环组蛋白H2B的水平。盒须图表示四组中的H2B水平。箱表示四分位数范围，水平线表示中位数，而须线表示第10和第90百分位数。水平表示为H2B的ngmL。为了评估观察到的差异在统计学上是否显著，我们进行了ANOVA检验p0.0001。事后检验Scheffé指示，脓毒性休克样品和ICU对照组p0.0001、普通群体对照组p0.0001和脓毒症组p＝0.001之间存在统计学差异。

权利要求：1.一种用于诊断或检测人对象脓毒症或脓毒性休克的基于质谱的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用质谱仪测量由从对象分离的血液、血清或血浆组成的一种或多种生物样品中至少循环组蛋白H3的水平或浓度；以及将来自疑似患有脓毒症或脓毒性休克的对象的一种或多种生物样品的所述循环组蛋白的水平或浓度与参考值或与来自由正常对象的血液、血清或血浆组成的生物样品的所述循环组蛋白的水平或浓度进行比较，其中正常对象是未患脓毒症或脓毒性休克的健康对象，其中循环组蛋白H3的水平或浓度相当于肽SEQIDNO1STELLIR的量，并且其中为了测量生物样品中循环组蛋白H3的水平或浓度，获得SEQIDNO1的平均比，并且其中至少循环组蛋白H3的水平或浓度的增加指示脓毒症或脓毒性休克。2.根据权利要求1所述的基于质谱的方法，其特征在于，组蛋白H3的参考值是86.36ngmL，并且其中增加至少1.5倍指示脓毒症或脓毒性休克。3.根据权利要求1至2中任一项所述的基于质谱的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：通过使用质谱仪测量由从对象分离的血液、血清或血浆组成的一种或多种生物样品中至少循环组蛋白H2B的水平或浓度；以及将来自疑似患有脓毒症或脓毒性休克的对象的一种或多种生物样品的所述循环组蛋白的水平或浓度与参考值或与来自由正常对象的血液、血清或血浆组成的生物样品的所述循环组蛋白的水平或浓度进行比较，其中正常对象是未患脓毒症或脓毒性休克的健康对象，其中循环组蛋白H2B的水平或浓度相当于肽SEQIDNO2LLPGELAK的量，并且其中为了测量生物样品中循环组蛋白H2B的水平或浓度，获得SEQIDNO2的平均比，并且其中至少循环组蛋白H3和H2B的水平或浓度的增加指示脓毒症或脓毒性休克。4.根据权利要求3所述的基于质谱的方法，其特征在于，组蛋白H2B的对照值为212.03ngmL，并且其中增加至少1.5倍的指示脓毒症或脓毒性休克。5.一种用于预测预后人对象脓毒症或脓毒性休克的临床进展的基于质谱的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用质谱仪测量由从对象分离的血液、血清或血浆组成的一种或多种生物样品中至少循环组蛋白H3的水平或浓度；将来自疑似患有脓毒症或脓毒性休克的对象的一种或多种生物样品的所述循环组蛋白的水平或浓度与参考值进行比较，其中循环组蛋白H3的水平或浓度相当于肽SEQIDNO1STELLIR的量，其中为了测量生物样品中循环组蛋白H3的水平或浓度，获得SEQIDNO1的平均比，其中至少循环组蛋白H3的水平或浓度的增加指示负面的临床进展，并且其中临床进展是指患者的总体生存期。6.根据权利要求5所述的基于质谱的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：通过使用质谱仪测量由从对象分离的血液、血清或血浆组成的一种或多种生物样品中至少循环组蛋白H2B的水平或浓度；以及将来自疑似患有脓毒症或脓毒性休克的对象的一种或多种生物样品的所述循环组蛋白的水平或浓度与参考值进行比较，其中循环组蛋白H2B的水平或浓度相当于肽SEQIDNO2LLPGELAK的量，并且其中为了测量生物样品中循环组蛋白H2B的水平或浓度，获得SEQIDNO2的平均比，并且其中至少循环组蛋白H3和H2B的水平或浓度的增加指示负面的临床进展，并且其中临床进展是指患者的总体生存期。7.权利要求5或6中任一项所述的基于质谱的方法，其特征在于，组蛋白H3的参考值是1348.13ngmL，并且其中增加至少1.5倍指示负面的临床结果。8.权利要求5至7中任一项所述的基于质谱的方法，其特征在于，组蛋白H2B的参考值是1426.38ngmL，并且其中增加至少1.5倍指示负面的临床结果。9.一种用于在人对象中区别化诊断脓毒症与脓毒性休克的方法，所述人对象疑似患有任何这些病状，其中，所述方法包括以下步骤：通过使用质谱仪测量由从对象分离的血液、血清或血浆组成的一种或多种生物样品中至少循环组蛋白H3和H2B的水平或浓度；以及将来自疑似患有脓毒症或脓毒性休克的对象的一种或多种生物样品的所述循环组蛋白的水平或浓度与参考值进行比较，其中至少循环组蛋白H2B的水平或浓度的增加指示脓毒性休克。10.根据权利要求9所述的区别化诊断方法，其特征在于，循环组蛋白H2B的水平或浓度相当于肽SEQIDNO2LLPGELAK的量，并且其中为了测量生物样品中的循环组蛋白H2B的水平或浓度，获得SEQIDNO2的平均比，其中循环组蛋白H3的水平或浓度相当于肽SEQIDNO1STELLIR的量，并且其中为了测量生物样品中循环组蛋白H3的水平或浓度，获得SEQIDNO1的平均比。11.试剂盒用于诊断或检测人对象脓毒症或脓毒性休克的体外用途，所述试剂盒包含：SEQIDNO1的肽和或SEQIDNO2的肽，其中这些肽优选用至少一种或多种重氨基酸合成，并且其中所述肽优选在C-末端氨基酸残基中用标签来标记。12.试剂盒用于诊断或检测人对象脓毒症或脓毒性休克的体外用途，所述试剂盒包含：SEQIDNO1的肽和SEQIDNO2的肽，其中这些肽优选用至少一种或多种重氨基酸合成，并且其中所述肽优选在C-末端氨基酸残基中用标签来标记。13.试剂盒用于预测预后人对象脓毒症或脓毒性休克的临床进展的体外用途，所述试剂盒包含：SEQIDNO1的肽和或SEQIDNO2的肽，其中这些肽优选用至少一种或多种重氨基酸合成，并且其中所述肽优选在C-末端氨基酸残基中用标签来标记。14.试剂盒用于预测预后人对象脓毒症或脓毒性休克的临床进展的体外用途，所述试剂盒包含：SEQIDNO1的肽和SEQIDNO2的肽，其中这些肽优选用至少一种或多种重氨基酸合成，并且其中所述肽优选在C-末端氨基酸残基中用标签来标记。15.根据权利要求13或14中任一项所定义的试剂盒的体外用途，其特征在于，用于在人对象中区别化诊断脓毒性休克与脓毒症，所述人对象疑似患有任何这些病状。

百度查询： 生物医学网络研究中心(CIBER-ISCIII);因克立瓦基金会;瓦伦西亚大学 检测脓毒症或脓毒性休克（SS）患者血浆中的循环组蛋白H3和H2B的基于质谱的方法

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