申请/专利权人：上海交通大学

申请日：2022-02-22

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN114426982B

主分类号：C12N15/74

分类号：C12N15/74;C12N15/65;C40B50/06;C40B40/02;C12N1/21;C12N15/54;G16B35/20;G16B35/10;G16B25/20;G16B30/10;C12R1/63

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2022.05.20#实质审查的生效;2022.05.03#公开

摘要：本发明公开了一种细胞代谢重编程的方法及其应用，属于基因工程领域，本发明利用细胞代谢网络的敏感节点对代谢网络进行重编程，主要包括基于CRISPRi的双基因组合敲弱、细胞高通量筛选和基于幸存率的基因交互作用分析三部分，本发明提供了一个新颖的、简单高效的、成本低廉的智能代谢重编程方法，可广泛用于操作细胞代谢网络。

主权项：1.一种细胞代谢重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建基于CRISPRi的双sgRNA敲弱的菌株文库；S2、进行细胞高通量筛选；S3、基于幸存率的基因交互作用分析；所述S1包括以下步骤：S1.1、构建工具质粒：将两个sgRNA表达框构建到pE1A质粒上，并在所述两个表达框中间插入毒性蛋白ccdB和GoldenGate的酶切位点；S1.2、构建双sgRNA文库的重组片段：合成目标文库的n对引物，以S1.1获得的工具质粒为模板，通过PCR扩增双sgRNA文库片段，纯化后，通过GoldenGate方法酶切酶连，将所述文库片段连接到S1.1获得的工具质粒上，获得双sgRNA文库的重组体系；具体的引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示：NO.3：5-GATCGAAGACACACTAGTNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3；NO.4：5-GATCGAAGACTAAAACNNNACTAGTATTATACCTAGGACTGAG-3；S1.3、构建双sgRNA文库的质粒：将所述双sgRNA文库的重组体系转化到大肠杆菌E.coliK12中，涂布到有筛选抗性的固体平板上，采用液体培养基洗脱，获得双sgRNA文库质粒菌株，将所述菌株作为种子液，在含有筛选抗性的培养基中扩培后，再提取质粒，获得双sgRNA文库的质粒；S1.4、构建基于CRISPRi的双sgRNA敲弱文库菌株：将S1.2得到的双sgRNA文库质粒转化到含有dCas9表达模块的pS8K质粒的菌株中，获得基于CRISPRi的双sgRNA敲弱文库菌株，并进行活性验证；S2中所述高通量筛选包括以下步骤：将所述双sgRNA敲弱文库菌株的目标产物对应的生物传感器和下游报告基因egfp偶联，构建到含有dCas9表达模块的pS8K质粒中，并转化到S1.4所获得的菌株中，通过流式细胞分选技术进行细胞分选，所述生物传感器选自核糖体开关、调控蛋白或转录调控因子任一种；所述S3包括以下步骤：提取S2获得的荧光值相比对照组高的细胞质粒，通过PCR扩增出多样性片段送二代测序，利用分析程序包进行基于幸存率的基因交互分析，所述利用分析程序包进行交互分析包括以下步骤：S3.1建立目标基因的NiNj序列库，NiNj为双N20序列；S3.2利用Python3程序提取测得序列的双N20区域的序列；S3.3利用Bowtie2算法将测得的序列与已经建立的双N20序列库进行比较；S3.4比较得到的结果具体展现为Excel表格和热图。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 上海交通大学 一种细胞代谢重编程的方法及其应用

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