申请/专利权人：云南云测质量检验有限公司;云南师范大学

申请日：2023-09-25

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN117230156B

主分类号：C12Q1/6806

分类号：C12Q1/6806;C12Q1/682;G01N27/327;G01N21/33

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2024.01.02#实质审查的生效;2023.12.15#公开

摘要：本发明属于生物传感检测技术领域，具体公开一种双模态适体生物传感器及其在赭曲霉毒素A检测中的应用，传感器基于滚环扩增信号放大策略，其中应用的滚环链复合物的制备方法，包括以下步骤：将Primerprobe和Padlockprobe混合，加入连接缓冲液A退火3min，冷却;所得产物，加入T4DNA连接酶，在37℃下反应3h，然后加入dNTP、phi29DNA聚合酶和缓冲溶液B，在37℃条件下，进行50min的滚环复制，然后在75℃条件下加热灭活终止反应，制得所需的产物，应用本发明的滚环扩增信号放大策略制备获得的传感器灵敏度高、选择性好、稳定性高。

主权项：1.一种双模态适体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：AuNPs@Fe-MIL-88SA复合物的制备；S1-1：Fe-MIL-88的制备将0.756g2-氨基对苯二甲酸和1.122gFeCl3·6H2O溶解在90mLDMF中；加入10mL乙酸并在120℃下，搅拌持续加热5h，冷却至室温后，8000rmin离心收集沉淀物，并用DMF和无水乙醇分别洗涤3次，最后，将产物于60℃下真空干燥，获得Fe-MIL-88粉末；S1-2：AuNPs@Fe-MIL-88的制备将100mgFe-MIL-88粉末分散在去离子水50mL中，持续搅拌下缓慢加入50mLAuNPs，室温搅拌24h，用无菌水洗涤3次，将产物于60℃下真空干燥后获得AuNPs@Fe-MIL-88产物；S1-3：取10mgAuNPs@Fe-MIL-88溶于500μL灭菌水中，与200μL、400mmolLEDC和200μL、100mmolLNHS混合反应30min，离心，用缓冲溶液C清洗两次，得沉淀；S1-4：将沉淀物分散到200μL灭菌水中，加入200μL、0.5mgLSA，在4℃下振荡反应4h，在同一温度下加入250μL、10μmolLDNA1链反应2h，所述DNA1链序列如SEQIDNO：5所示；S1-5：最后，另取1mL10%MCH加入到S1-4的混合溶液，在4℃下振荡1h封闭非特异性结合位点，把混合溶液离心10000rmin3min，并用缓冲溶液D清洗两次，将产物分散在500μL灭菌水中，得到AuNPs@Fe-MIL-88SA复合物，保存在4℃环境下备用；S2：传感器的制备，包括以下步骤：S2-1：10μL5mgmL的氨基磁珠中加入10μL0.5mmolLSulfo-SMCC和30μLPBST缓冲溶液，在37℃条件下震荡2h；S2-2：用PBST洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入25μL5μmolLmDNAOTAaptamer双链复合物、5μL100mmolLTCEP和20μLPBST缓冲溶液，在37℃条件下震荡过夜反应，所述mDNAOTAaptamer双链复合物由序列如SEQIDNO：2所示的mDNA和序列如SEQIDNO：1所示的OTAaptamer等浓度等比例混合制备获得；S2-3：用PBST洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入1%BSA震荡反应30min以封闭活性位点；S2-4：用PBST洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入10μL赭曲霉毒素A和40μLPBST缓冲溶液，在37℃条件下震荡1h；S2-5：用PBST洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入50μL2.78μmolL滚环链复合物，在37℃条件下震荡2h；S2-6：用PBST洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入10μLAuNPs@Fe-MIL-88SA复合物和40μLPBST缓冲溶液，在37℃条件下震荡2h；S2-7：反应结束用PBST洗涤，弃去上层溶液，加入10μL0.005gmL壳聚糖与氨基磁珠均匀混合以后，即获得双模态适体生物传感器；所述滚环链复合物的制备方法，包括以下步骤：（1）将10μL5.76μmolLprimerprobe和10μL5.76μmolLPadlockprobe混合，加入20μL连接缓冲液A退火3min，在室温下逐渐冷却3h;（2）步骤（1）所得产物，加入2μL5UμLT4DNA连接酶，在37℃下反应3h，使得Padlockprobe链闭合起来；（3）然后加入5μL10mmolLdNTP、5μL10UμLPhi29DNA聚合酶和20μL缓冲溶液B，在37℃条件下，进行50min的滚环复制，然后在75℃条件下加热灭活终止反应，制得所需的产物；所述Primerprobe序列如SEQIDNO：3所示；所述Padlockprobe序列如SEQIDNO：4所示；步骤（3）中的缓冲溶液B由50mmolLTrisHCl、10mmolLMgCl2、10mmolLNH42SO4、4mmolLDTT混合而成；步骤（1）中，连接缓冲液A由5mmolLTrisHCl、1mmolLMgCl2、0.1mmolLATP和1mmolLDTT构成；缓冲溶液C为浓度25mmolLPBS，pH7.4，缓冲溶液D为浓度10mmolLPBS，pH7.4。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 云南云测质量检验有限公司;云南师范大学 双模态适体生物传感器及其在检测赭曲霉毒素A中的应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD