申请/专利权人：杨凌凯瑞生物科技有限公司

申请日：2018-04-23

公开（公告）日：2024-03-29

公开（公告）号：CN108586618B

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;C12N1/19;A61K39/215;A61P31/14;A61P1/12;C12R1/865

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.29#授权;2020.09.01#专利申请权的转移;2018.10.26#实质审查的生效;2018.09.28#公开

摘要：本发明提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物及应用，该疫苗组合物包含了猪流行性腹泻亚单位抗原及其佐剂。所述亚单位抗原由S1核心抗原的受体结合区和免疫球蛋白的Fc片段串联表达而成的融合蛋白，可以通过毕赤酵母高效表达和分泌，工艺简单，成本低廉，便于大规模生产。本发明还提供了该亚单位疫苗的制备方法及疫苗效果，通过免疫小鼠，能够产生比市场灭活苗更高的中和抗体滴度，避免了灭活制备中全病毒难以分离和大规模培养的问题。

主权项：1.一种重组蛋白S1-RBD-Fc，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。

全文数据：一种猪流行性腹泻亚单位疫苗的制备及应用[0001]技术领域：本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的亚单位抗原及与佐剂乳化后疫苗组合物的制备与应用。[0002]背景技术：流行性腹泻（PED是由猪流行性腹泻病毒PEDV引起的一种猪的急性、高度接触性肠道传染病，主要特征为腹泻、呕吐、脱水和高死亡率，自2010年以来，以PEDV变异株为主引起的PED在我国各省份广泛流行，发病率达20%-100%，死亡率达40%-100%，对我国养猪业造成了严重的经济损失。目前还没有治疗PED的有效药物，疫苗免疫接种是防控PED的主要手段。[0003]当前市场上的疫苗主要是PED灭活疫苗、PED弱毒疫苗，以及PED与TGEV和或RV组合在一起的二联苗和三联苗。此外，国内外很多猪场一直在推荐使用返饲疫苗来预防PED。尽管以上多个类型的疫苗在猪场中广泛使用，但是PED每年在我国不同区域都会暴发流行，造成大面积新生仔猪感染死亡。[0004]猪流行性腹泻病毒S蛋白是猪流行性腹泻病毒中的4个结构蛋白之一，作为纤突蛋白（spike，位于病毒粒子表面的糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后，通过膜融合侵入宿主细胞，和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要作用，是主要的免疫优势抗原，该蛋白由1383或1386个氨基酸组成，包括2个功能区，Sl区（1-789和S2区790-1383区介导识别，受体结合区域RBD位于Sl的羧基端，Sl-RBD为猪流行性腹泻病毒的Spike蛋白的受体结合区，氨基酸对应位置为490-638，不同毒株间有1-5个左右氨基酸的差异，相对保守，该区域包含了重要的构象中和表位，是PEDV疫苗设计的候选抗原。[0005]术语免疫球蛋白Fc片段是指免疫球蛋白IgG的重链恒定区CH2和CH3，还可进一步含有重链恒定区的铰链区，本发明中主要做药物载体。该Fc片段可获至人，或包括牛，羊，猪，小鼠，大鼠在内的其它动物中分离的天然形式，或是重组体及衍生物，可被转化的动物细胞或微生物。优选地，选择人IgGl抗体的恒定区序列，作为重组体进行重组表达。[0006]发明内容：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种融合蛋白及疫苗组合物的制备方案和应用。该疫苗组合物可以有效预防或治疗猪流行性腹泻病毒导致的疾病。[0007]为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种重组蛋白Sl-Rm-Fc，其氨基酸序列为：aSEQIDNo.1所示的氨基酸序列;或bSEQIDNo.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。[0008]应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的重组蛋白SI-RBD-Fc的氨基酸序列SEQIDNO.1片段，在不影响其功能的前提下，本发明的重组蛋白还包括SEQIDNO.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与重组蛋白同等活性的由Sl-RBD-Fc衍生得到的蛋白质。[0009]本发明中重组蛋白Sl-RBD-Fc的制备方法是将编码融合蛋白的基因经过优化，克隆到毕赤酵母载体中，电转化，导入毕赤酵母并发生重组，抗生素筛选高表达菌株，该重组蛋白包含了核心抗原Sl-RBD和免疫球蛋白的恒定区Fc。[0010]根据本发明的一个方面，本发明还提供了编码上述重组蛋白的基因，如SEQIDNo.2所示的核酸序列。[0011]根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有表达融合蛋白的宿主菌PidapastorisGSl15pPICZaA-KB3-S-RBD-HlFc17#〇[0012]本发明中的疫苗组合物包含佐剂，所述佐剂包含铝胶佐剂，皂苷，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂，大肠杆菌不耐热肠毒素，霍乱毒素，单磷脂脂质A，MF佐剂中一种或几种，优选地，所述佐剂为MF59。[0013]本发明中的疫苗组合物，佐剂与融合蛋白的配比为1:1，融合蛋白的含量为lygmL-200ygmL，优选为10ygmL_50ygmL。[0014]本发明具有以下突出的优点：首先，所述疫苗组合物中的融合蛋白可以通过毕赤酵母高密度发酵表达，纯化工艺简单，便于大规模生产。其次，所述疫苗组合物，相比灭活苗和病毒苗，可以预防由猪流行性腹泻病毒引起的腹泻疾病。免疫效果更好。最后，很容易通过基因工程手段改造融合蛋白，适应不同流行性腹泻毒株的遗传变异。附图说明[0015]图1:抗原基因序列PCR扩增结果:M:DL2000DNAmarker;泳道1和2:目的基因大小约1200bp左右。[0016]图2:酵母重组子表达鉴定结果:M:Proteinmarker27716;泳道1:阳性对照含组氨酸标签蛋白66kDa;泳道2:GSl15pPICZaA阴性对照；泳道3-9:GSl15pPICZaA-KB3-S-RBD-H1FC重组转化子表达上清。[0017]图3:BCA法蛋白测定标准曲线图。具体实施方式[0018]下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0019]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售或商业途径获得。[0020]本发明实施例中的重组酵母菌株PiohapastorisGS115pPICZaA-KB3-S-RBD-HlFc17#的菌株保藏号为:CCTCCNO.M2018117,保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为:2018年4月4日。[0021]实施例1:融合蛋白Sl-RBD-Fc的制备，鉴定和含量测定。[0022]猪流行性腹泻病毒融合蛋白的制备、鉴定1.1.1重组载体的构建根据序列表SEQIDNO.2所述的核酸序列，采用人工合成的方法，有武汉金开瑞生物科技有限公司合成，所合成的基因全长为1223bp。以合成的基因为模板，设计一对特异性引物，序列如下：Fla-S-his6-Fl:5’-CGGGAATTCAACATTAACAACAACTTGC-3’；Fla-S-his6-Rl:5’-CGGCTCGAGCTTACCTGGAGACAAAGAC-3’。[0023]通过PCR的方法扩增片段。PCR条件为:98度预变性2min，98度变性15s，56度退火30s,72度延伸30s，30个循环，72度延伸5min。[0024]PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳30min，在紫外切胶仪上切下目的条带，然后通过DNA凝胶回收试剂盒回收目的产物PCR结果如图1所示）。[0025]重组载体pPICZaA和PCR产物以同样的限制性内切酶EcoRI和Sail双酶切，酶切产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳30min，在紫外切胶仪上切下约3500bp左右的载体骨架片段或1300bp左右目的基因片段，通过DNA凝胶回收试剂盒回收载体骨架片段和目的基因。[0026]设置连接反应体系，30ng的pPICZaA酶切骨架，50ng的融合基因Sl-RBD-Fc产物，1μ1的10倍反应缓冲液NEBBuffer4，100U的Τ4DNA连接酶，补水到ΙΟμΚΙθΓ反应2个小时，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a中，活化经博莱霉素筛选平板上的克隆子，提取质粒，经酶切和PCR鉴定为阳性的克隆子进行测序。测序结果如序列表SEQIDNO.2所示。[0027]重组菌株的获得和表达鉴定重组质粒的电转化:分别取IOyLPmeI线性化5-10yg的重组质粒pPICZaA-KB3-S491-638-HlFc加入80μ1GS115,并轻轻混匀，分别转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，采用伯乐电转化仪1500V电击，博来霉素抗性筛选阳性克隆子，使用毕赤酵母载体上的通用引物5’AOX和3’AOX筛选酵母重组子。[0028]筛选的阳性重组子在3mL的BMGY培养基中活化培养2天，换液到等体积的BMMY中，持续以0.5%甲醇诱导表达。离心收集培养上清，上清产物经12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western鉴定目的蛋白的表达。结果表明，目的蛋白能够分泌表达到酵母培养上清中，WB结果见图2表明目的蛋白可以与鼠抗his标签单抗反应。[0029]融合蛋白纯化按1.1.2表达方法，发酵得到2L培养上清，经切向流超滤浓缩至400mL，用Ni-NTA亲和纯化柱纯化，通过含20mM,50mM咪唑的平衡液50mMTris,300mMNaCl,pH7.9洗涤杂蛋白，而目的蛋白在含300mM咪唑的平衡液中洗脱，经一步纯化，目的蛋白纯度可达90%。[0030]纯化的蛋白经I3BS透析3次，每次6个小时。超滤管浓缩至5ml，0.22um的水系膜过滤除囷，分装。[0031]融合蛋白的浓度测定以血清白蛋白作为参考蛋白，参考北京康为世纪生物科技公司的BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。融合蛋白按稀释5倍测定吸光值。测定的标准曲线拟合的公式如下：Y=1.3856X+0.0714，见附图3。蛋白浓度按公式计算为：1.120mgmL。[0032]表1蛋白浓度测定数据表实施例2:疫苗组合物的配制和纯净性检验2.1佐剂配制配制MF59佐剂含5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温60、93%0.005M柠檬酸钠）：将处方量的吐温80与柠檬酸钠缓冲液搅拌混匀，再加入处方量的油酸、角鲨烷，高压均质机1200bar，进行5个循环，然后收集料液，0.22μπιΡΊΈΕ膜过滤除菌；2.2疫苗配比融合蛋白按给药剂量10,20,50，IOOyg的剂量分别与佐剂按1:1的比在无菌环境中，搅拌混合均匀，标记并分组。[0033]表2动物分组记录表实施例3:疫苗组合物的动物评价实验3.1疫苗组合物动物安全性检验3.1.1性状检验疫苗组合物外观呈粉红色乳胶状，无分层。[0034]3.1.2无菌检验疫苗组合物按照现《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部附录进行检验，T.G、G.P管和G.A斜面培养基均未观察到菌落。[0035]3.1.3安全检验取猪PEDV病毒抗体、抗原均为阴性的3日龄猪24头，随机分成4组，每组6头，肌注10头份疫苗，临床观察14日，均66健活，未见不良反应发生。[0036]疫苗组合物中和抗体水平检验1材料与方法取产前42天猪PEDV抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪30头，随机分成6组，每组5头，分组实验见图表1，第1组肌肉注射疫苗组合物亚单位疫苗1头份头，抗原剂量为IOyg;第2组肌肉注射疫苗组合物亚单位疫苗1头份头，抗原剂量为20yg;第3组肌肉注射疫苗组合物亚单位疫苗1头份头，抗原剂量为5〇yg;第4组肌肉注射疫苗组合物亚单位疫苗1头份头，抗原剂量为1〇〇邱。第5组以市场灭活苗为对照;第6组PBS对照组。各组于免疫后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周采血，分离血清进行ELISA抗体检测和病毒中和试验。[0037]ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的MBP-S491-638-His6蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验建立间接ELISA方法。首先确定最佳包被浓度，然后以该浓度ΙΟΟμΙ孔，4°C孵育过夜;洗涤4次，每次Imin;每孔加ΙΟΟμμΙ的1%BSA封闭液封闭板子，37°C作用2h;将待检血清用含0.1%的BSA的PBS进行倍比稀释，每个样品一行，每孔加ΙΟΟμΙ，37°C作用Ih;洗涤;然后加入HRP标记的抗猪二抗稀释度1:1W，每孔加ΙΟΟμΙ，37°C作用Ih;洗涤;每孔加ΙΟΟμΙ底物TMB显色，37°C作用IOmin;最后用2NH2S04终止反应。结果判定:待检血清0D450阳性血清0D450彡0.5为阳性，检测数据如图表2。[0038]表3待检血清的抗体检测和中和效价注:0.2,0.4,0.6,0.8,1.0分别代表每组中分别有1只到5只小鼠产生阳性抗体的比值。[0039]血清中和实验采用固定病毒稀释血清法。将待检血清56°C灭活30min，12000rpm离心5min，取上清，进行倍比稀释；分别与等体积的200TCID50KB3毒株病毒液混合，37°C作用lh，接种于含单层Vero细胞的96孔板内，每孔ΙΟΟμΙ，每一稀释度接种6孔，同时设置细胞对照和病毒对照，培养72h，用预冷80%丙酮进行固定，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。[0040]表4血清中和效价不同时间的血清效价表注:NA:稀释比例低于1:8判定为阴性4结果抗体检测和中和病毒滴度检测数据如图表3:本发明所制备的疫苗，在剂量IOOyg仔猪免疫后21天产生中和抗体，持续21天均可检测到抗体，第三组剂量50yg，首免后第28天产生的抗体滴度水平最高，中和抗体效价达到1:128以上，明显高于市场灭活苗产生的中和抗体水平。IOOyg的抗原剂量产生抗体水平与50μg剂量相当，20yg的抗原剂量水平与市场灭活苗在抗体产生时间和中和抗体水平相当，因此优选20yg-50yg的抗原剂量，同MF59佐剂混合配苗，在达到同等的免疫效果的同时，降低生产成本。对于较强的腹泻感染预防，可以采用50yg-100yg剂量的抗原，以达到更好的免疫效果。

权利要求：1.一种重组蛋白Sl-RBD-Fc，其氨基酸序列为：aSEQIDNo.1所示的氨基酸序列;或bSEQIDNo.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的重组蛋白Sl-RBD-Fc的制备方法，其特征在于，是将编码融合蛋白的基因经过优化，克隆到毕赤酵母载体中，电转化，导入毕赤酵母并发生重组，抗生素筛选高表达菌株，该重组蛋白包含了核心抗原Sl-RBD和免疫球蛋白的恒定区Fc。3.根据权利要求2所述的重组蛋白Sl-RBD-Fc的制备方法，其特征在于，编码重组蛋白Sl-RBD-Fc的核酸序列如SEQIDNo.2所示。4.一种重组酵母菌株PichapasiorisGS115pPICZaA-KB3-S-RBD-HlFc17#，其菌株保藏号为:CCTCCNO.M2018117,保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为:2018年4月4日。5.权利要求1所述的重组蛋白Sl-RBD-Fc在制备猪流行性腹泻亚单位疫苗中的应用。6.—种疫苗组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的重组蛋白Sl-RBD-Fc和佐剂。7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂包含铝胶佐剂，皂苷，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂，大肠杆菌不耐热肠毒素，霍乱毒素，单磷脂脂质A，MF佐剂中一种或几种，优选地，所述佐剂为MF59。8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，佐剂与重组蛋白Sl-RBD-Fc的配比为1:1〇9.根据权利要求7-8任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，重组蛋白Sl-RBD-Fc的含量为lygmL-SOClygmL，优选为10ygmL_50ygmL。

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