申请/专利权人：江苏鼎泰药物研究(集团)股份有限公司

申请日：2022-02-21

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN114686418B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2022.07.19#实质审查的生效;2022.07.01#公开

摘要：本发明公开了一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法。属于生物医药领域，具体步骤：将人源诱导多能干细胞诱导分化为肝谱系内胚层细胞并进行鉴定；再将肝谱系内胚层细胞诱导分化成肝细胞并进行鉴定。本发明诱导来的肝细胞诱导过程可见细胞形态的改变，对过程中细胞进行相关蛋白或基因表达鉴定可提示诱导是否成功；诱导来的肝细胞具有糖原储存能力，对ICG有摄取和释放作用分泌白蛋白的能力与iPSC相比，增加了九倍以上；肝细胞的尿素产量增加了39倍；利用该方法，可在较短时间内获得具有接近原代肝细胞功能的体外诱导肝细胞，本发明能快速有效将人源诱导多能干细胞定向诱导分化为功能性肝细胞，推动药物的肝脏毒性研究。

主权项：1.一种将hiPSC定向分化为功能性肝细胞的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：1、首先，将人源诱导多能干细胞诱导分化为肝谱系内胚层细胞；将hiPSC用培养基稀释至4×104cellscm2的浓度，后将其铺设于基质胶培养皿中进行培养；其中，在其培养至6至7天后进行传代一次；所述的培养基主要为干细胞培养基，并添加有干细胞培养添加剂和Y27632；2、其次，对肝谱系内胚层细胞的功能进行鉴定；首先，在进行诱导的第0天，将进行了消化的hiPSC使用培养基稀释至5×106cellswell的浓度，后将其接种于铺设有基质胶的六孔板中进行培养7天，从而形成肝谱系内胚层；然后，对形成的肝谱系内胚层进行基因鉴定和纯度分析，确定诱导成为完全内胚层；将步骤1中消化后的hiPSC使用培养基稀释至5×106cellswell每孔的浓度接种于铺有基质胶的六孔板中，其中，所述培养基具体是：在第0天，所述培养基为RIMP1640、含B27添加剂、ActivinA、CHIR99021及RockInhibitor；其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、ActivinA的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM、RockInhibitor的含量是10μM；在第1天至第3天，所述培养基换为RIMP1640、含B27添加剂、ActivinA、CHIR99021及丁酸钠；其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、ActivinA的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM、丁酸钠的含量是0.5μM；在第4天至第6天，所述培养基换为RIMP1640、含B27添加剂、ActivinA和CHIR99021，每天换液；其中，所述含B27添加剂的含量是0.5X、ActivinA的含量是10μM、CHIR99021的含量是2μM；所述的鉴定方法包括流式细胞术检测和RT-PCR；所述流式细胞术检测的细胞表面标记物为CXCR4、EpCAM和C-KIT；所述RT-PCR法的处理过程为收集所需诱导时间点的细胞，诺唯赞试剂盒提取细胞总RNA并转录成cDNA，利用试剂盒的反应系统进行RT-PCR反应；3、然后，将肝谱系内胚层细胞诱导分化成肝细胞；培养7天后，将hiPSC进行消化，进行消化后重新铺板至24孔板中，在24孔板中重新铺板后第15天，进行肝细胞的收集；具体的，将hiPSC消化后重新铺板至24孔板；其具体地是：将细胞消化后用HCMEGM培养基进行重悬，培养基成分为：HCMEGM、FBS、DeX、OSM，调整密度后，于Corning的24孔板进行铺板，分别在第8、9、10、12、14、16、18、20天进行换液，直到第22天，回收上清并收集肝细胞；4、最后，对诱导分化成的肝细胞的功能进行鉴定；所述的鉴定方法包括显微镜形态学观察和RT-PCR；其中，所述流式细胞术检测的细胞表面标记物为CXCR4、EpCAM和C-KIT；所述RT-PCR检测的mRNA为OCT4、NANOG、CER1CER1、CXCR4、FOXA2和HNF4A；所述RT-PCR检测的mRNA包括肝细胞基因和细胞色素P450编码基因；所述肝细胞基因包括ALB、G6PC、RBP4、TTR和TDO2；所述细胞色素P450编码基因包括CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4；所述流式细胞术的处理过程为收集第7天的细胞，经PBS洗两遍后，用CXCR4、EpCAM和C-KIT荧光抗体标记细胞，4℃冰箱孵育30分钟，后用PBS清洗两遍，重悬细胞后，在全数字光谱流式仪上进行细胞分析；具体包括：免疫荧光染色检测ALB表达；PAS染色检测肝细胞的糖原储存能力；ICG检测肝细胞的摄取和释放能力；直接比色法进行肝细胞尿素产量分析；CYP3A4酶活分析；所述的免疫荧光染色方法具体步骤如下：用4％的多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗后，用1％TritonX-100进行细胞破膜15分钟，再用PBS漂洗3次，再用3％的BSA室温封闭30分钟，PBS漂洗3次，加入相应的一抗ALB，4℃冰箱过夜孵育，PBS漂洗3次，再加入相应二抗室温孵育60分钟，加入DAPI后在共聚焦显微镜下拍摄；所述的PAS染色检测肝细胞的糖原储存能力的具体步骤如下：使用碧云天的PAS染色试剂盒，先用PBS洗涤细胞，并在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤后，细胞用0.5％高碘酸溶液氧化7分钟，PBS洗涤，入Schiff试剂加盖阴暗处孵育15分钟，在亚硫酸钠溶液和PBS先后洗涤细胞，最后再用显微镜观察；所述的ICG检测肝细胞的摄取和释放能力的具体步骤如下：10mg吲哚菁绿粉溶解在10ml肝细胞培养基中，获得1mgml的原液；细胞在ICG培养基中以37℃培养4h后弃去含有ICG的培养基，PBS洗涤3次，显微镜下观察细胞对ICG的摄取的情况并拍照；再在细胞中加入新鲜的培养基，培养4h，显微镜下观察细胞释放ICG情况。

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