申请/专利权人：华南农业大学

申请日：2021-08-02

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN113604498B

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;A01H5/06;A01H6/54

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2021.11.23#实质审查的生效;2021.11.05#公开

摘要：本发明公开了一种柱花草毛状根诱导方法，包括发根农杆菌的选择和培养、柱花草外植体的获得、柱花草外植体的侵染、柱花草毛状根的诱导和毛状根脱菌培养及扩繁，毛状根诱导率达到58.3％。本发明柱花草毛状根诱导方法为柱花草的分子生物学研究提供重要的技术支撑，具有较大的应用前景。

主权项：1.一种柱花草毛状根诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.发根农杆菌的选择和培养：将发根农杆菌菌株MSU440活化、培养成发根农杆菌菌液待用；S2.柱花草外植体的获得：切取萌发后的柱花草幼苗子叶为外植体；S3.柱花草外植体的侵染：将步骤S2的柱花草外植体与步骤S1发根农杆菌菌液共培养；S4.柱花草毛状根的诱导：将步骤S3侵染后的柱花草外植体在无菌水中共培养4～6天后，转移到共培养液浸润的无菌滤纸共培养12～15天，在切口处初步获得毛状根；S5.毛状根脱菌培养及扩繁：待毛状根长至2cm以上，将毛状根转化体用含有抗生素的无菌水冲洗三次，转移到含抗生素的MS培养基中，继代培养若干次，直到发根农杆菌被完全灭杀，最后转移到12MS培养基中繁殖毛状根；步骤S1所述发根农杆菌菌液为从活化后的发根农杆菌菌株MSU440种子菌液中吸取200～300µL接种至5～10mLYEP液体培养基中，26～28℃170～190rmin振荡培养至OD为0.5～0.6；步骤S2所述柱花草外植体为萌发2天，带1mm下胚轴的柱花草幼苗子叶；步骤S2所述萌发为：将柱花草种子解除休眠后消毒、灭菌，置于萌发培养基中培养萌发；培养温度22～24℃，光照强度110～130μmol·m-2·S-1，每天光照时间为15～17小时，相对湿度为55～65%；步骤S4所述共培养液组成为：0.4125g·L-1NH4NO3、0.48g·L-1KNO3、0.11g·L-1CaCl2·2H2O、0.0925g·L-1MgSO4·7H2O、0.0425g·L-1KH2PO4、0.2075mg·L-1KI、1.54mgL-1H3BO3、5.56mg·L-1MnSO4·4H2O、2.65mg·L-1ZnSO4.7H2O、0.0625mg·L-1Na2MoO4·2H2O、0.00625mg·L-1CuSO4·5H2O、0.00625mg·L-1CoCl2·6H2O、9.325mg·L-1Fe-EDTA、25mg·L-1肌醇、0.5mg·L-1甘氨酸；0.5%蔗糖；步骤S4在无菌水中培养为24～26℃，光照强度39000～39100lx，每天光照时间15～17小时，相对湿度为45～55%共培养4～6；所述柱花草外植体与共培养液培养为温度22～24℃，光照强度为39000～39100lx，光照共培养12～15天；步骤S5所述含抗生素的无菌水和含抗生素的MS培养基中的抗生素均为羧苄青霉素，浓度为4～6gL；所述柱花草品种为RY2。

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