申请/专利权人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

申请日：2023-12-25

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN117512076B

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2024.02.27#实质审查的生效;2024.02.06#公开

摘要：本发明公开了一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法，涉及RNA检测技术领域。其包括如下步骤：将待测RNA序列、sgRNA‑P1和sgRNA‑P2进行混合反应，再将Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与混合反应后的产物混合，反应后检测反应产物中的荧光标记物的荧光强度，以此作为检测结果判定。本发明基于CRISPR系统的检测原理提供的免反转录的RNA检测方法兼具高特异性、结果判读简单、操作简便、检测准确、通用性良好、检测成本低等技术优势。可以满足环境及仪器配置有限的地区的检测需求。

主权项：1.一种RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述检测方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下步骤：将待测RNA序列、sgRNA-P1和sgRNA-P2进行混合反应，再将Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与所述混合反应后的产物混合，反应后检测反应产物中的荧光标记物的荧光强度；所述sgRNA-P1的结构包括：5’-第一序列-第二序列-3’；所述第一序列与所述待测RNA序列的3’端的序列反向互补配对；所述第二序列为tracrRNA序列；所述sgRNA-P2的结构包括：5’-第三序列-第四序列-第五序列-3’；其中所述第五序列与所述待测RNA序列的5’端的序列反向互补配对；所述第三序列与所述双链DNA序列的其中一条链反向互补配对；所述第四序列与sgRNA-P1的部分所述第二序列反向互补配对，且所述第四序列的长度≥6bp；所述双链DNA由能够自发互补成双链结构的单链DNA形成；所述第一序列的长度为10-15bp，所述第五序列的长度为10-15bp；所述tracrRNA的序列为：AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU；所述sgRNA-P2的第四序列为：GGUUUUAGA，所述sgRNA-P2的第三序列为：AAUGGAGAGUUUGCAAGGA；所述待测RNA序列为单链RNA序列；所述待测RNA序列选自microRNA、解链后的siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、scRNA、SRPRNA和mRNA-like的非编码RNA中的至少一种；所述sgRNA-P1和sgRNA-P2的混合摩尔比为1:1~1.5；所述sgRNA-P1与Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列的混合摩尔比为0.8-1:0.8-1:2-3；所述待测RNA序列、sgRNA-P1和sgRNA-P2在37℃、pH7.5、10mM镁离子条件下进行“三元”自组装反应；反应时间为10-20分钟；所述Cas蛋白为Cas9蛋白；所述Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与混合反应后的产物混合后的反应条件为：20-40℃，反应20-40分钟；所述荧光标记物为荧光报告基团和荧光淬灭基团；所述双链DNA序列的其中一条链标记有荧光报告基团，所述双链DNA序列的另一条链标记有荧光猝灭基团；对目标RNA样本进行定量检测的方法包括：采用所述RNA免反转录的检测方法获得已知RNA含量的同一种RNA的荧光强度，并绘制RNA含量与荧光强度的标准曲线；根据目标RNA样本的荧光强度在标准曲线上获得对应的RNA含量。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法

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