申请/专利权人：王富安;王逸飞;武汉大学深圳研究院

申请日：2024-03-19

公开（公告）日：2024-04-16

公开（公告）号：CN117887814A

主分类号：C12Q1/6816

分类号：C12Q1/6816;C12Q1/6886;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.04.16#公开

摘要：本发明公开了一种基于内源性GSH的核酸线路调控方法，属于分子检测领域。本发明通过在核酸反应物探针中接枝双硫键，实现细胞内源性GSH对核酸线路的特异性调控，只有完成激活剂GSH和目标物的逻辑激活后，核酸线路才能有效运作，产生输出信号。本方法极大降低了传统核酸线路的异地激活以及反应物间非特异性相互作用的弊端，实现了高特异性目标物检测和多重保障的原位细胞成像。本方法可用于DNA和miRNA的体外检测以及不同细胞系的选择性区分，具有较高的特异性和稳定性，为疾病和癌症的早期诊断提供了有效工具。

主权项：1.一种基于细胞内源性谷胱甘肽的核酸分子线路调控方法，其特征在于，包含如下步骤：1探针反应物的设计：传统的EDC线路反应物由三链体底物SS1*S2*S3和燃料Fuel链组成。以此作为一种通用型的DNA线路，本发明设计了一种由双链体底物S0S1*S4和发卡探针H链组成的GSH激活的EDCHAD线路。首先运用NUPACK软件对HAD线路探针底物S0和发卡H进行结构设计。针对于底物S0的结构设计：S0由S1和S4通过碱基互补配对杂交得到，其中单链核酸S1被设计为具有三段不同识别能力的功能域a、b、c、d，单链核酸S4被设计为具有三段不同识别能力的功能域e、f图1A。S1的a可与S4的f杂交，b、c可与S4的e杂交，d为识别目标物的单链粘性末端，在S4的e、f间修饰DL以响应GSH。S1的3’端标记有BHQ1猝灭剂,为荧光猝灭基团；S4的5’端标记有FAM荧光团,为报告荧光基团。当GSH存在时，底物探针S0的DL位点被断裂，恢复反应活性。针对发卡H的结构设计：H被设计为具有三个不同功能的部分g、h、i，其中g与i可通过碱基互补配对互补，作为发卡的茎部，h为发卡结构的环部即为Fuel链，g、h和h、i间分进行DL修饰以响应GSH。H链通过快速退火发生自身杂交得到稳定的发卡结构。当GSH存在时，H链的DL位点被断裂，发生构象转变，将Fuel单链释放出来。2基于HAD线路实现DNA的体外检测：在三羟甲基氨基甲烷乙酸乙二胺四乙酸盐缓冲液TAEMg2+中，将所有DNA探针S0100nM，H150nM与GSH和目标DNA混合，在37℃下孵育5h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度；或者，基于HAD线路实现miRNA的体外检测：在三羟甲基氨基甲烷乙酸乙二胺四乙酸盐缓冲液TAEMg2+中，将所有DNA探针S0100nM，H150nM与GSH和目标miRNA混合，在37℃下孵育5h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度；上述方法中，所述的三羟甲基氨基甲烷乙酸乙二胺四乙酸盐缓冲液含有50mM的三羟甲基氨基甲烷，20mM的乙酸，2mM的EDTA，pH为8.5，含12.5mMMg2+。

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