申请/专利权人：浙江华睿生物技术有限公司

申请日：2018-08-10

公开（公告）日：2020-07-03

公开（公告）号：CN108998401B

主分类号：C12N1/21(20060101)

分类号：C12N1/21(20060101);C12N15/70(20060101);C12P13/04(20060101);C12P13/06(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.03#授权;2019.01.08#实质审查的生效;2018.12.14#公开

摘要：本发明公开了一种通过代谢工程生产3‑氨基异丁酸的方法，3‑氨基异丁酸产生菌的构建包括下述步骤：A.敲除大肠杆菌MG1655基因组中的ptsG、fumAC和fumB基因，获得基因敲除菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB；B.构建表达基因panD、aspA和C24MTgm的表达质粒；C.将步骤B中所得的质粒转化入步骤A中所得的基因敲除菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB中，获得基因工程菌株。本发明构建的大肠杆菌工程菌能够产生3‑氨基异丁酸，摇瓶发酵的氨基异丁酸产量可高达100mgL。

主权项：1.一种构建3-氨基异丁酸生产菌株的方法，包括以下步骤：A.敲除大肠杆菌MG1655基因组中的ptsG、fumAC和fumB基因，获得基因敲除菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB；B.构建表达L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD、天冬氨酸酶基因aspA和甲基转移酶基因C24MTgm的表达质粒；C.将步骤B中所得的质粒转化入步骤A中所得的基因敲除菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB中，获得基因工程菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB,panD,aspA,C24MTgm。

全文数据：一种生产3-氨基异丁酸的方法技术领域[0001]本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种构建3-氨基异丁酸生产菌株的方法，尤其涉及一种通过代谢工程改造菌株来生产3-氨基异丁酸和或β-丙氨酸的方法。背景技术[0002]3-氨基异丁酸又称β-氨基异丁酸β-ΑΙΒ或3-氨基-2-甲基丙酸，化学结构式如下：[0004]3-氨基异丁酸是一种非蛋白氨基酸，是胸腺嘧啶和缬氨酸的一种代谢产物，经尿液排出，其中R-构型为来自胸腺嘧啶，S构型来自缬氨酸，尿液中R-构型占比超过90%。研究发现，β-ΑΙΒ作为白色脂肪组织产热程序中非肾上腺素激活剂家族的第一种代表性的小分子myokine，对II型糖尿病和代谢疾病具有较好的成药潜力。除此之外，3-氨基异丁酸可以用作化工原料和医药中间体。作为有机合成原料，其拥有20余种上游产品及10余种下游产品。在作为医药中间体方面的应用和研究更是非常广泛。[0005]目前3-氨基异丁酸主要用化学方法制备，虽然产物得率高，但合成步骤中需要昂贵的催化剂和大量的盐酸，同时会产生剧毒氰化物，对环境产生很大污染。随着环保要求的提高，开发环境友好的绿色生产方法很有必要。发明内容[0006]为了克服现有化学合成3-氨基异丁酸方法的高污染问题，本发明利用代谢工程来改造基因工程中应用最广泛的大肠杆菌，开发出微生物发酵法生产3-氨基异丁酸的途径。通过改变大肠杆菌原有的代谢路线，在大肠杆菌中表达PanD基因，菌株具有合成β-丙氨酸功能;然后在该菌株中表达甲基转移酶基因，使其可以合成3-氨基异丁酸。具体而言，本发明采用如下技术方案：[0007]—种构建3-氨基异丁酸生产菌株的方法，包括以下步骤：[0008]Α.敲除大肠杆菌MG1655基因组中的ptsG、fumAC和fumB基因，获得基因敲除菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB；[0009]B.构建表达L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD、天冬氨酸酶基因aspA和甲基转移酶基因C24MTgm的表达质粒；[0010]C.将步骤B中所得的质粒转化入步骤A中所得的基因敲除菌株MG1655AptsGAfumACΔfumB中，获得基因工程菌株MG1655ΔptsGAfumACΔfumB,panD，aspA，C24MTgm，从而使L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD、天冬氨酸酶基因aspA和甲基转移酶基因C24MTgm过表达。[0011]优选地，上述步骤B中所述基因PanD是序列SEQIDNO:1。[0012]优选地，上述步骤B中所述基因aspA是序列SEQIDNO:2。[0013]优选地，上述步骤B中所述基因C24MTgm是序列SEQIDN0:3。[0014]在一种实施方式中，上述步骤B中基因panD、aspA和C24MTgm可以被各自构建在质粒上；或者panD、aspA和C24MTgm被构建在同一个质粒上；或者panD、aspA和C24MTgm中的任意两个基因可以被构建在一个质粒上、而第三个基因被构建在另一个质粒上。[0015]优选地，上述步骤B中基因PanD和aspA被构建在一个质粒上，基因C24MTgm被构建在另一个质粒上。[0016]上述步骤C中的转化可以为氯化钙转化法或电转化，优选电转化。[0017]根据本发明的第二个方面，提供了一种大肠杆菌工程菌，其按照上述的方法构建。[0018]根据本发明的第三个方面，提供了上述工程菌在3-氨基异丁酸和或β_丙氨酸的生产中的应用。[0019]该基因工程菌既可以直接作为发酵菌株通过发酵来生产3-氨基异丁酸，也可以作为出发菌株做进一步改良以便筛选出3-氨基异丁酸生产能力进一步提高的新的生产菌。[0020]所述发酵可以用葡萄糖作为碳源。比如，发酵培养基组成如下：（NH42SO415gL，酵母提取物l.〇gL，葡萄糖[0021]本发明以大肠杆菌作为起始菌株，运用分子生物学技术改造基因组，构建得到的重组工程菌能够过表达与β-丙氨酸产生相关的基因PanD和aspA、以及与后续产生3-氨基异丁酸相关的C-甲基转移酶基因C24MTgm，其以葡萄糖作为碳源，可以通过发酵得到3-氨基异丁酸和或丙氨酸。经摇瓶发酵验证，氨基异丁酸的最高产量可达到l〇〇mgL，显示出本发明的方法具有工业化应用潜力。附图说明[0022]图1为本发明构建的panD和aspA基因表达质粒pTrcHis2B_panDaspA的结构示意图。[0023]图2为本发明构建的C24MTgm基因表达质粒pSU-lacIqTrc-C24MTgm的结构示意图。具体实施方式[0024]以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。[0025]本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明夕卜，皆指质量百分含量。[0026]在本文中，术语“大肠杆菌MG1655”、“原始菌株MG1655”、“E.coliMG1655”表示相同的意义，都是指作为基因改造对象的原始菌株。[0027]在本文中，术语“基因敲除菌株MG1655”和“MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB”表示相同的意义，都是指大肠杆菌MG1655基因组中ptsG、fumAC和fumB基因被敲除的菌株。[0028]为了构建3-氨基异丁酸工程生产菌，本发明首先对大肠杆菌进行了遗传改造优化，敲除基因组中ptsG、fumAC和fumB基因，从而调整改变了葡萄糖代谢途径;并且强化L-天冬氨酸脱羧酶基因PanD和天冬氨酸酶基因aspA的表达，实现大肠杆菌利用葡萄糖碳源高效合成β-丙氨酸的目的；通过过表达编码C-甲基转移酶基因，实现由β-丙氨酸合成3-氨基异丁酸的目的。[0029]大肠杆菌MG1655基因组中ptsG、fumAC和fumB基因的敲除方式可以是使用CRISPR-Cas9工具进行基因编辑技术，具体可参考文献Jiang，Y.，B.Chen，C.Duan，B.Sun,J.YangandS.Yang.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2015,817:2506-2514〇[0030]为达到合成β-丙氨酸的目的，以质粒pTrCHis2B为载体，过表达来源于大肠杆菌的panD和aspA基因，将表达质粒pTrcHis2B_panDaspA转化MG1655基因敲除菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB，得到转化子MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB,panD，aspA。[0031]为达到进一步合成3-氨基异丁酸的目的，以pSU2718质粒为出发载体，克隆来源于大豆的天然C-甲基转移酶基因C24MTgm，并转化入上述转化子MG1655AptsGAfumACAfumB，panD，aspA，得到转化子MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB，panD，aspA，C24MTgm。基因C24MTgm可根据NCBI蛋白质序列GenBankIDAAB04057.1基于大肠杆菌的密码子频率进行密码子优化设计，进行基因合成获得。[0032]实验发现，上述转化子MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB，panD，aspA菌株可产生β-丙氨酸，转化子MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB，panD，aspA，C24MTgm菌株可进一步产生3-氨基异丁酸，验证了本发明的代谢工程设计思想的正确性。[0033]实施例[0034]材料和方法[0035]本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。[0036]本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》第三版），J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔（美编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》第三版第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。[0037]主要培养基及缓冲液：[0038]LB培养基:蛋白胨10gL，氯化钠10gL，酵母粉5.0gL固体培养基添加琼脂粉20，ρΗ=7·0〇[0039]发酵培养基组成如下：（NH42S〇415gL，KH2P〇45.0gL，Na2HP〇4·12H2015gL，MgS〇4*7H201.0gL，酵母提取物1.0gL，葡萄糖20gL，pH7.0。[0040]以下实施例中，当使用含抗生素的培养基时，抗生素的终浓度为氨苄青霉素100μgml，氯霉素40ygml，根据转化质粒的特征，按需添加相应的抗生素。[0041]菌株培养条件：固体培养基37°C静置培养。液体培养基培养37°C，230rpm摇床培养。[0042]实施例中所涉及的PCR用酶KODFX购自东洋纺公司，限制性内切酶购自Thermofisher公司，Gibson组装试剂盒购自NEB公司，axygenDNA纯化及质粒抽提试剂盒购自杭州爱思进公司，实验操作参照其产品使用说明书进行。[0043]20X电转母液:80gL甘氨酸，2%吐温80。[0044]β-丙氨酸的分析方法：色谱柱为LaChromC185um，4.6*250mm;流动相A液为80%VV腈水溶液，B液为97:3VV，pH=6.5的0.lmolL乙酸钠-乙腈溶液;采用梯度洗脱：0-15min，B液由95%下降65%;15-20min，B液由65%上升到95%;20-30min，B液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40°Cο[0045]3-氨基异丁酸的分析方法：以邻苯二甲醛作为衍生剂，对样品进行柱前衍生，色谱柱为安捷伦SB-C18，流动相为乙酸钠浓度为2.87lgL的30%甲醇水溶液，柱温30°C，检测波长334nm，检测时长IOmin，保留时间为5.Imin。[0046]实施例1:敲除pstG基因、fumAC基因簇和fumB基因的菌株的构建[0047]1.1将pCAS质粒（由中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所馈赠，参JALJiang,Y.,B-Chen,C.Duan1B-Sun,J.YangandS.Yang.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2015,817:2506-2514通过电转化转入大肠杆菌MG1655中，获得MG1655pCAS菌株。以pTargetF质粒（由中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所馈赠，参见Jiang,Y.，B.Chen,C.Duan，B.Sun,J.YangandS.Yang.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2015,817:2506-2514为模板，使用pTargetFApstG-FpTargetFΔpstG-R引物，进行反向PCR，上述PCR产物电转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司），培养后抽提质粒，获得pTargetFApstG质粒。PCR引物对为：[0048]正向pTargetFΔpstG-F:[0049]5’-TCCTAGGTATAATACTAGTCAATCCAGACCTTCTCTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’，[0050]反向pTargetFΔpstG-R:5’-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG-3’。[0051]1.2以MG1655基因组DNA为模板，以ΔpstG-up-arm-FΔpstG-up-arm-R引物进行PCR扩增，获得上游同源序列，以ΔpstG-down-arm-FΔpstG-down-arm-R引物扩增获得下游同源序列，对上述两片段进行over-lapPCR，获得用于敲除ptsG基因的供体DNA片段。PCR引物对为：[0052][0053][0054][0055][0056][0057][0058]使用pTargetFΔpstG质粒和上述供体DNA片段，转化MG1655pCAS菌株，获得ptsG敲除菌株MG1655pCASΔpstG。[0059]1.3以pTargetF质粒为模板，以pTargetFAfumAC-FpTargetFAfumAC-R引物，进行反向PCR，上述PCR产物电转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司），培养后抽提质粒，获得pTargetFΔfumAC质粒。PCR引物对为：[0060][0061][0062][0063]1.4以MG1655基因组DNA为模板，以ΔfumAC-up-arm-FΔfumAC-up-arm-R引物进行扩增，获得上游同源序列，以ΔfumAC-down-arm-FΔfumAC-down-arm-R引物进行扩增，获得下游同源序列，对上述两片段进行over-lapPCR，获得用于敲除基因簇fumAC的供体DNA片段。PCR引物对为：[0064][0065][0066][0067][0068][0069][0070]将上述pTargetFΔfumAC质粒和fumAC供体DNA片段共转化MG1655pCASΔpstG菌株，获得fumAC敲除菌株MG1655pCASΔpstGΔfumAC。[0071]1.5以pTargetF质粒为模板，以pTargetFAfumB-FpTargetFAfumB-R为引物，进行反向PCR，上述PCR产物电转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司），培养后抽提质粒，获得PTargetFΔfumB质粒。PCR引物对为：[0072][0073][0074][0075]1.6以MG1655基因组DNA为模板，以ΔfumB-up-arm-FΔfumB-up-arm-R为引物进行扩增，获得上游同源序列，以ΔfumB-down-arm-FΔfumB-down-arm-R引物进行扩增，获得下游同源序列，对上述两片段进行over-lapPCR，获得用于敲除fumB的供体DNA片段。PCR引物对为：[0076][0077][0078][0079][0080][0081]将上述pTargetFΔfumB质粒和fumB供体DNA片段共转化MG1655pCASΔpstGΔfumAC菌株，获得fumB敲除菌株MG1655pCASΔpstGΔfumACΔfumB。进一步将该菌接种LB培养基，37°C过夜培养，消除pCAS质粒，获得基因敲除菌株MG1655ΔpstGΔfumACΔfumB。[0082]实施例2:基因panD和aspA表达质粒的构建[0083]将PTrcHis2B质粒Thermofisher公司）进行BamHIHindlll双酶切，获得酶切后片段。以161655基因组0嫩为模板，使用?11〇4^?11〇43-1?引物进行?0財广增，获得?11〇基因片段。以MG1655基因组DNA为模板，使用aspA-Ec-FaspA-Ec-R引物进行PCR扩增，获得aspA基因片段。PCR引物对为：[0084][0085][0086][0087][0088][0089][0090][0091]按照GibsonAssembly®_MasterMix的操作方法说明，将pTrcHis2B质粒BamHIHindIII酶切片段、panD基因片段和aspA基因片段进行组装克隆，获得panD和aspA基因的表达质粒pTrcHis2B_panDaspA，其结构如图1所示。[0092]实施例3:基因C24MTgm表达质粒的构建[0093]3.1以pSU2718质粒（由中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所馈赠）为模板，使用pSU2718-FpSU2718-R引物，PCR扩增获得pSU2718载体片段。以pTrcHis2B质粒为模板，使用lacIqTrc-FlacIqTrc-R引物，PCR扩增IacIqTrc片段。PCR引物对为：[0094][0095][0096][0097][0098]3.2将IacIqTrc片段与pSU2718载体骨架PCR片段进行Gibson组装克隆，获得质粒pSU-lacIqTrc。根据NCBI的Glycinemax相关GenBank:U43683.1序列合成S-腺苷-L-甲硫氨酸δ24-固醇-C-甲基转移酶基因C24MTgm苏州金唯智生物科技有限公司）。使用C24MTgm-FC24MTgm-R引物扩增C24MTgm基因片段。片段经BamHIHindlll双酶切后克隆入质粒pSU-IacIqTrc的BamHIHindlll位点，获得C24MTgm表达质粒pSU-lacIqTrc_C24MTgm，其结构如图2所示。PCR引物对为：[0099][0100][0101][0102]实施例4:β_丙氨酸生产菌株和3-氨基异丁酸生产菌株的构建[0103]4.1将实施例2中构建的基因panD和aspA表达质粒pTrcHis2B-panDaspA转化入实施例1中构建的基因敲除菌株MG1655ΔpstGΔfumACΔfumB中，获得工程菌MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB，panD,aspA，其可以过表达基因panD和aspA，通过发酵产生β-丙氨酸，命名为S1。[0104]4.2将实施例3中构建的基因0241〇^111表达质粒?31]-13191'代-0241«^111转化入上述实施例4·l中构建的工程菌MG1655△ptsGΔfumACΔfumB，panD，aspA中，获得工程菌MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB,panD,aspA,C24MTgm，其可以过表达C24MTgm基因，通过发酵产生3-氨基异丁酸和β-丙氨酸，命名为S2。[0105]实施例5:菌株发酵[0106]将原始菌株MG1655、基因敲除菌株MG1655ΔpstGΔfumACΔfumB、菌株Sl和菌株S2分别进行种子培养和发酵，发酵培养基装液量30250ml，37°C，230rpm发酵24-32h，测定丙氨酸以及3-氨基异丁酸含量。[0107]结果显不，菌株MG1655和菌株MG1655ΔpstGΔfumACΔfumB均无β-丙氨酸和3-氨基异丁酸生成；菌株Sl可生成500mgL的β-丙氨酸，无氨基异丁酸生成；菌株S2可生成100mgL的3-氨基异丁酸，同时仍有300mgL的β-丙氨酸积累，具有工业化应用前景。[0108]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应以权利要求书所界定的为准。

权利要求：1.一种构建3-氨基异丁酸生产菌株的方法，包括以下步骤：A.敲除大肠杆菌MG1655基因组中的ptsG、fumAC和fumB基因，获得基因敲除菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB；B.构建表达L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD、天冬氨酸酶基因aspA和甲基转移酶基因C24MTgm的表达质粒；C.将步骤B中所得的质粒转化入步骤A中所得的基因敲除菌株MG1655AptsGAfumACΔfumB中，获得基因工程菌株MG1655ΔptsGΔfumACΔfumB,panD，aspA，C24MTgm。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述基因panD是序列SEQIDNO:1。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述基因aspA是序列SEQIDN0:2。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述基因C24MTgm是序列SEQIDNO:3〇5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中基因panD、aspA和C24MTgm被各自构建在质粒上；或者panD、aspA和C24MTgm被构建在同一个质粒上；或者panD、aspA和C24MTgm中的任意两个基因被构建在一个质粒上、而第三个基因被构建在另一个质粒上。6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤C中所述转化为氯化钙转化法或电转化。7.—种大肠杆菌工程菌，其特征在于，按照权利要求1中所述的方法构建。8.如权利要求7所述工程菌用于生产3-氨基异丁酸和或β-丙氨酸的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，通过发酵来生产3-氨基异丁酸和或β-丙氨酸。10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：（NH42S〇415gL，KH2P〇45.0gL，Na2HP〇4*12H2015gL，MgS〇4*7H201.0gL，酵母提取物1.0gL，葡萄糖20gL，pH7.0。

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