申请/专利权人：山东省农业科学院植物保护研究所

申请日：2017-08-16

公开（公告）日：2021-01-12

公开（公告）号：CN107254547B

主分类号：C12Q1/6848(20180101)

分类号：C12Q1/6848(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.12#授权;2017.11.14#实质审查的生效;2017.10.17#公开

摘要：本发明公开了一种使PCR偏向于扩增小片段产物的添加剂，所述的添加剂为镧系元素离子，本发明首次将Ln3+应用于PCR技术，目的是去除PCR反应中大片段产物无论这种大片段产物是特异性的还是非特异性的，只扩增小片段产物，提高小片段产物的比率；还可以延长多轮PCR中小片段产物的扩增轮数，弥补现有添加剂优化效果的空白。此外，Ln3+容易获得，成本低廉，应用于PCR技术操作简便。

主权项：1.镧离子、铈离子、镨离子或铽离子在转基因玉米NK603中CaMv35S基因偏向于扩增小片段产物中的应用，其特征在于，La3+为3.9-5.5μM、Ce3+为3.5-5.6μM、Pr3+为2.8-5.2μM、Tb3+为2.3-3.9μM。

全文数据：一种使PCR偏向于扩増小片段产物的添加剂技术领域[0001]本发明涉及镧系元素离子新应用，尤其涉及一种镧系元素离子在使PCR偏向于扩增小片段产物中的应用。背景技术[0002]聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction，PCR是现代生物学和医学应用最广泛的技术之一，可使目的DNA分子的合成量呈指数增长，因此微量的遗传物质在数小时内即能扩增数百万倍达到检测水平，进而可进行DNA测序、分子诊断、基因分析等。然而在实际应用中仍然存在一些难以克服的难题，如假阴性、假阳性、非特异性扩增以及片状拖带或涂抹带等。为此，研究人员研发了多种多样的PCR添加剂，有传统添加剂如甲酰胺、乙酰胺、非离子去污剂、DMS0、氯化四甲基铵、甜菜碱等;新型添加剂如纳米金、碳纳米管、氧化石墨烯等。这些添加剂侧重于提高PCR的特异性和产物的产量，在一定程度上改善了PCR技术，然而在一些去除大片段特异性扩增上仍然难以奏效。例如，当引物所在位置存在重复序列时会产生非靶标的大片段扩增产物，这种大片段产物是由于模板DNA中存在多个引物结合位点造成的，是特异性扩增的，但同时也是需要去除的非靶标产物，在这种实例中，上述已有添加剂难以达到理想的优化效果。[0003]镧系元素是元素周期表中第三副族中原子序数从57到71的15种元素。镧系元素具有未充满的4f电子层，使得4f电子的不同排布会产生f-f组内或f-d组态间的跃迀，当4f电子在不同的能级跃迀时就会产生大量的能量吸收和荧光光谱的特征信息，因此被广泛的应用于荧光材料、稀土金属氢化物电池材料、储氢材料、催化材料、激光材料等。目前，尚未见报道将镧系元素离子应用于PCR技术。发明内容[0004]本发明的目是提供一种使PCR偏向于扩增小片段产物的添加剂，所述添加剂中包括镧系元素离子，该添加剂的使用克服了目前的PCR添加剂无法去除大片段特异性扩增产物的难题。[0005]本发明目的之二提供镧系元素离子Ln3+在PCR技术中的应用，具体的应用方法：向PCR反应溶液中加入Ln3+，然后再进行反应，由于Ln3+的加入，能使PCR偏向于扩增小片段产物。[0006]本发明目的之三提供镧系元素离子Ln3+在延长多轮PCR中小片段产物的扩增轮数中的应用。[0007]本发明的一个实施例中提到，Ln3+在转基因玉米NK603中CaMv35S基因扩增中的应用。[0008]本发明的另一个实施例中提到，Ln3+在水稻内参基因SPS扩增中的应用。[0009]本发明具体实施例中所使用的镧系元素离子Ln3+为镧离子La3+、铈离子Ce3+、镨离子Pr3+或铽离子Tb3+。优选的：所使用的镧系元素离子化合物为LaCl3·7H20、CeCl3·6H20、PrCl3·6H20或TbCl3·6H20。[0010]镧系元素离子作为添加剂使PCR偏向于扩增小片段产物的应用中，所述的Ln3+用量以可产生优化聚合酶链式反应效果的量为准。[0011]优选的：La3+为3.9-6.4μΜ，更优选为4.8-5.5μΜ;Ce3+为3.3-5.6μΜ，更优选为3.5_5·ΙμΜ;Pr3+为2·7-5·4μΜ，更优选为2·8-5·2μΜ;Tb3+为2·3-4·2μΜ，更优选为2·4-3·9μΜ;μΜ为Ln3+离子在PCR反应液中的终浓度。[0012]本发明的有益效果在于:本发明首次将Ln3+应用于PCR技术，目的是去除PCR反应中大片段产物无论这种大片段产物是特异性的还是非特异性的），只扩增小片段产物，提高小片段产物的比率;还可以延长多轮PCR中小片段产物的扩增轮数，弥补现有添加剂优化效果的空白。此外，Ln3+容易获得，成本低廉，应用于PCR技术操作简便。附图说明[0013]图1为实施例1所用模式PCR图解，左图为扩增区域结构示意，右图为PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；[0014]图2为不同浓度的Ln3+对转基因玉米ΝΚ603中CaMv35S基因扩增的优化所得产物的琼脂糖凝胶电泳图；[0015]图3为实施例2所用模式PCR图解，左图为扩增区域结构示意，右图为PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；[0016]图4为不同浓度的Ln3+对水稻内参基因SPS扩增的优化所得产物的琼脂糖凝胶电泳图；[0017]图5为Ln3+对多轮PCR中小片段产物扩增的优化效果。具体实施方式[0018]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。[0019]下列实施例中试剂来源为:植物基因组总DNA采用康为世纪生物科技有限公司植物DNA提取试剂盒（CW0531S提取，2XPremixrTaq购自大连TaKaRa公司，引物和LaCl3·7H20、CeCl3·6H20、PrCl3·6H20、TbCl3·6H20购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Marker为天根生化科技北京有限公司MarkerI。[0020]实施例1不同浓度的Ln3+对转基因玉米NK603中CaMv35S基因扩增的优化效果[0021]CaMv35S基因为转基因玉米NK603的启动子，其序列结构上存在增强子序列。采用国家标准检测方法（弓丨物序列为：F:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC，R:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC扩增NK603中CaMv35S基因片段，该标准方法的上游引物在CaMv35S和增强子上均存在结合位点，该方法的产物共有三条，分别为195bp的小片段特异性靶标产物、450bp的大片段特异性非靶标产物和520bp的大片段非特异性杂带（图1。在这三条产物中，只有195bp的小片段产物是检测需要的，其余均需去除。本实施例的目的是比较未添加Ln3+和添加不同量Ln3+对PCR中大片段非特异性产物和大片段特异性非靶标产物的优化效果。[0022]IPCR反应体系组成（20yL:[0023][0024]所述Ln3+溶液为LaCl3·7H20、CeCl3·6H20、PrCl3·6H20和TbCl3·6H20各自的水溶液，其在PCR反应体系中终浓度分别为:La3+:0-7.ΙμΜ;Ce3+:0-6.3μΜ;Pr3+:0-6.ΟμΜ;Tb3+:0-4·7μΜ〇[0025]2PCR扩增程序为：95cC5min;95cC30s，58cC30s，72cC30s，35个循环；72cC7min。[0026]3对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：[0027]扩增结果如图2所示，其中，各泳道所对应的样品如下：[0028]M:分子量标记MarkerI，自下至上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp;[0029]La3+对PCR的优化，从左向右泳道La3+终浓度依次为0、2.3、3.1、3.9、4.7、5.5、6.3和7.ΙμΜ，在终浓度为3.ΙμΜ时，520bp的大片段非特异性杂带消失，终浓度为3.9-5.5μΜ时，520bp的大片段非特异性杂带和450bp的大片段非靶标条带同时消失；[0030]Ce3+对PCR的优化，从左向右泳道Ce3+终浓度依次为0、1.9、2.8、3.5、4.2、4.9、5.6和6.3μΜ，在终浓度为2.8μΜ时，520bp的大片段非特异性杂带消失，终浓度为3.5-5.6μΜ时，520bp的大片段非特异性杂带和450bp的大片段非靶标条带同时消失；[0031]Pr3+对PCR的优化，从左向右泳道Pr3+终浓度依次为0、1.2、2.0、2.8、3.6、4.4、5.2和6.ΟμΜ，在终浓度为2.ΟμΜ时，520bp的大片段非特异性杂带消失，终浓度为2.8-5.2μΜ时，520bp的大片段非特异性杂带和450bp的大片段非靶标条带同时消失；[0032]Tb3+对PCR的优化，从左向右泳道Tb3+终浓度依次为0、0.7、1.2、1.5、2.3、3.1、3.9和4.7μΜ，在终浓度为1.5μΜ时，520bp的大片段非特异性杂带消失，终浓度为2.3-3.9μΜ时，520bp的大片段非特异性杂带和450bp的大片段非靶标条带同时消失；[0033]由实施例1可知，Ln3+不仅能去除PCR反应的大片段杂带，也能去除大片段的非靶标产物，使得PCR只进行小片段的靶标产物扩增，从而准确的对CaMv35S基因进行检测。[0034]实施例2不同浓度的Ln3+对水稻内参基因SPS扩增的优化效果[0035]使用生物学软件Oligo7.4设计扩增水稻SPS基因片段的半两重PCR，引物序列为：上游引物F:TTGGCACAGCAAGACACTCC;下游引物Rl:TCGCCACTAACTAGACCATGAAGAC，下游引物R2:GTAATACGCAACCATGCAGGG;FR1所扩增产物大小为233bp，FR2所扩增产物大小为386bp图3。本实施例的目的是比较未添加Ln3+和添加不同量Ln3+对PCR中大片段靶标产物的优化效果。[0036]IPCR反应体系组成20yL:[0037][0038]所述Ln3+溶液为LaCl3·7H20、CeCl3·6H20、PrCl3·6H20和TbCl3·6H20各自的水溶液，其在PCR反应体系中终浓度分别为:La3+:0-7.ΙμΜ;Ce3+:0-6.9μΜ;Pr3+:0-6.3μΜ;Tb3+:0-5·1μΜ〇[0039]⑵PCR扩增程序参照实施例1。[0040]⑶对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：[0041]扩增结果如图4所示，其中，各泳道所对应的样品如下：[0042]Μ:分子量标记MarkerI，自下至上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；[0043]La3+对PCR的优化，从左向右泳道La3+终浓度依次为0、3.2、4.0、4.8、5.6、6.4和7.1μΜ，在终浓度为4.8-6.4μΜ时，386bp的大片段靶标产物消失；[0044]Ce3+对PCR的优化，从左向右泳道Ce3+终浓度依次为0、2.4、3.2、4.2、5.1、6.0和6.9μΜ，在终浓度为3.3-5.ΙμΜ时，386bp的大片段靶标产物消失；[0045]Pr3+对PCR的优化，从左向右泳道Pr3+终浓度依次为0、1.9、2.7、3.6、4.5、5.4和6.3μΜ，在终浓度为2.7-5.4μΜ时，386bp的大片段靶标产物消失；[0046]Tb3+对PCR的优化，从左向右泳道Tb3+终浓度依次为0、1.3、1.6、2.4、3.3、4.2和5.1μΜ，在终浓度为2.4-4.2μΜ时，386bp的大片段靶标产物消失；[0047]由实施例2可知，Ln3+能够去除大片段的靶标产物，使得PCR只进行小片段的靶标产物扩增，从而提高小片段产物的比率。[0048]实施例3Ln3+对多轮PCR的优化效果[0049]对实施例2中所用PCR体系进行多轮扩增，即以上轮PCR产物为模板配制反应体系进行下一轮PCR扩增，选取终浓度为5.ΟμΜ的La3+为例验证Ln3+对多轮PCR中小片段产物的优化效果图5，即Ln3+能延长多轮PCR中小片段产物扩增的轮数。[0050]IPCR反应体系组成20yL:[0051][0052]⑵PCR扩增程序参照实施例I，共扩增7轮。[0053]3对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：[0054]扩增结果如图4所示，其中，各泳道所对应的样品如下：[0055]M:分子量标记MarkerI，自下至上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；[0056]在无La3+存在时，PCR扩增至第2轮即产生大量弥散产物，特异性产物生成量大大减少，从第3轮开始则完全变成样孔带，无特异性产物生成；当PCR体系中加入终浓度为5.ΟμΜ的La3+时，小片段产物可成功扩增至第5轮，大大延长了扩增轮数。由此可知，Ln3+能促进小片段产物在多轮PCR扩增时的轮数。[0057]上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

权利要求：1.一种使PCR偏向于扩增小片段产物的添加剂，其特征是:具有镧系元素离子。2.镧系元素离子在使PCR偏向于扩增小片段产物或在延长多轮PCR中小片段产物的扩增轮数中的应用。3.镧系元素离子在转基因玉米NK603中CaMv35S基因扩增中的应用。4.镧系元素离子在水稻内参基因SPS扩增中的应用。5.如权利要求3或4所述的应用，其特征是:所述镧系元素离子为镧离子、铈离子、镨离子或钺尚子。6.如权利要求5所述的应用，其特征是:所述镧离子、铈离子、镨离子或铽离子的来源分别为LaCl3·7H20、CeCl3·6H20、PrCl3·6H20和TbCl3·6H20。7.如权利要求5所述的应用，其特征是:所述La3+为3.9-6.4μΜ，更优选为4.8-5.5μΜ。8.如权利要求5所述的应用，其特征是:所述Ce3+为3.3-5.6μΜ，更优选为3.5-5.ΙμΜ。9.如权利要求5所述的应用，其特征是:所述Pr3+为2.7-5.4μΜ，更优选为2.8-5.2μΜ;10.如权利要求5所述的应用，其特征是:所述Tb3+为2.3-4.2μΜ，更优选为2.4-3.9μΜ。

百度查询： 山东省农业科学院植物保护研究所 一种使PCR偏向于扩增小片段产物的添加剂

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