申请/专利权人：华南农业大学

申请日：2019-07-19

公开（公告）日：2021-05-04

公开（公告）号：CN110338059B

主分类号：A01H4/00(20060101)

分类号：A01H4/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.04#授权;2019.11.12#实质审查的生效;2019.10.18#公开

摘要：本发明涉及一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法。该方法包括如下步骤：将根状茎接种至培养基上，培养，即可；所述培养基中添加有2～6mg·L‑1的硫酸铜。本发明研究发现，在常规的培养基中添加适宜浓度的硫酸铜，能显著提高国兰根状茎增殖率和分化率，显著提高国兰工厂化繁殖的效率，为“玉香兰”新品种推广和国兰产业化发展奠定技术基础。另外，该方法无需改变生产程序，几乎不增加成本，可显著提高国兰种苗工厂化生产效率，对建立国兰高效工厂化生产技术体系，推动国兰产业化发展有重要现实意义。

主权项：1.一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：将根状茎接种至培养基上，培养，即可；所述根状茎为无污染、活力高的根状茎；所述根状茎的长度为0.8～1.2cm；所述根状茎用于增殖培养时切除顶端；所述根状茎用于分化培养时保留顶端；所述培养基为增殖培养基或分化培养基；所述增殖培养基为MS培养基，所述增殖培养基中还添加有6-BA1.0～2.0mg·L-1，NAA0.2～0.5mg·L-1，AC0.3～0.5g·L-1，蔗糖30g·L-1，卡拉胶7.0～8.0g·L-1，硫酸铜2～4mg·L-1；所述分化培养基为MS培养基，所述分化培养基中还添加有6-BA1.5～3.0mg·L-1，NAA0.1～0.5mg·L-1，蔗糖30.0g·L-1，AC0～0.05g·L-1，卡拉胶7.0～8.0g·L-1，硫酸铜4～6mg·L-1。

全文数据：一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法技术领域本发明涉及生物技术领域植物组织培养范畴，特别涉及一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法。背景技术国兰ChineseCymbidiums是指兰属Cymbidium兰花中的地生种包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰和兔耳兰等及通过遗传改良培育的具有这类兰花特征特性的集体杂种如玉兔兰CymbidiumJadeHare或品种等。国兰在中国有着悠久的栽培历史和深厚的文化内涵，市场前景广阔。2015年国兰的国内年销售额为12.24亿元人民币，其中墨兰占比最高。随着我国经济的发展、人们生活质量的不断提高以及兰文化的普及和推广，国兰必将越来越受到国内消费者的喜爱。同时随着中国的逐渐强盛，作为中国传统文化载体的国兰还具有广阔的国际市场。种苗工厂化生产是兰花产业化发展的基础，传统国兰种苗工厂化繁殖效率低，无法实现种苗工厂化生产，已成为国兰产业化发展的主要障碍。目前传统国兰仍然主要靠分株繁殖生产种苗，这种繁殖方式不仅速度慢，不适应国兰新品种推广和产业化发展的要求，同时长期分株繁殖导致种苗质量下降，抗病性降低、茎腐病频发、成品生产中死亡率增高，效益降低，竞争能力减弱，这已导致一些生产者不得不放弃国兰生产。因此，培育适合产业化发展的易工厂化繁殖国兰新品种，提高国兰种苗工厂化繁殖效率，对进一步推动我国国兰产业转型升级，提高兰花产业源头创新能力、竞争力和效益，推广普及兰文化均具有重要意义。玉兔兰CymbidiumJadeHare是采用墨兰和兔耳兰杂交培育的集体杂种Grex，而“玉香兰”CymbidiumJadeHare‘Yuxiang’是从集体杂种中选育出的一个国兰新品种。“玉香兰”集墨兰和兔耳兰优良性状于一身，株型挺俊、小巧，叶形新颖，花紫红色，香气浓郁、抗性强、易栽培，具有广阔的市场前景。因此研究“玉香兰”种苗工厂化繁殖技术对加快新品种推广，提高国兰产业的科技含量、竞争力和效益具有十分重要的意义。发明内容本发明的目的在于克服现有国兰工厂化繁殖效率低，无法实现种苗工厂化生产的缺陷或不足，提供一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法。本发明通过在培养基中添加适宜的硫酸铜，能显著提高国兰根状茎增殖率和分化率，显著提高国兰工厂化繁殖的效率，为“玉香兰”新品种推广和国兰产业化发展奠定技术基础。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法，包括如下步骤：将根状茎接种至培养基上，培养，即可；所述培养基中添加有2～6mg·L-1的硫酸铜。本发明研究发现，在常规的培养基如增殖培养基中添加适宜浓度的硫酸铜，能显著提高国兰根状茎增殖率；在常规的培养基如分化培养基中添加适宜浓度的硫酸铜，能显著提高国兰根状茎和分化率。本发明的方法可显著提高国兰工厂化繁殖的效率，为“玉香兰”新品种推广和国兰产业化发展奠定技术基础。另外，该方法无需改变生产程序，几乎不增加成本，可显著提高国兰种苗工厂化生产效率，对建立国兰高效工厂化生产技术体系，推动国兰产业化发展有重要现实意义。根状茎的选取可按照常规的选取条件进行。优选地，所述根状茎为无污染、活力高的根状茎。优选地，所述根状茎的长度为0.8～1.2cm。优选地，所述根状茎用于增殖培养时切除顶端。优选地，所述根状茎用于分化培养时保留顶端优选地，所述培养基在接种前进行灭菌操作。可按照常规的灭菌条件进行灭菌。更为优选地，所述灭菌操作的过程如下：将培养基于120～125℃下灭菌20～30分钟。可利用高压灭菌锅实现该灭菌操作。本发明的培养基为常规的国兰根状茎进行增殖或分化的培养基。优选地，所述培养基为增殖培养基或分化培养基；所述增殖培养基中还添加有6-BA1.0～2.0mg·L-1，NAA0.2～0.5mg·L-1，AC0.3～0.5g·L-1，蔗糖30g·L-1，卡拉胶7.0～8.0g·L-1；所述分化培养基为MS培养基，所述分化培养基中还添加有6-BA1.5～3.0mg·L-1，NAA0.1～0.5mg·L-1，蔗糖30.0g·L-1，AC0～0.05g·L-1和卡拉胶7.0～8.0g·L-1。更为优选地，所述增殖培养基中6-BA的添加量为1.0mg·L-1，NAA的添加量为0.5mg·L-1，AC的添加量为0.5g·L-1，蔗糖的添加量为30.0g·L-1，卡拉胶的添加量为7.0g·L-1，pH为5.8±0.2。更为优选地，所述增殖培养基中硫酸铜的添加量为2～4mg·L-1。更为优选地，所述分化培养基中6-BA的添加量为1.5mg·L-1，NAA的添加量为0.5mg·L-1+蔗糖的添加量为30.0g·L-1，AC的添加量为0.05g·L-1的添加量为卡拉胶7.0g·L-1，pH为5.8±0.2。更为优选地，所述分化培养基中硫酸铜的添加量为4～6mg·L-1。更为优选地，所述增殖培养基或分化培养基通过如下过程制备得到：吸取MS培养基的大量、微量、铁盐、维生素以及6-BA、NAA和硫酸铜母液放入烧杯中待用；将卡拉胶用水煮熔，加入蔗糖、母液和AC后定容，调节pH即得。根状茎的接种量可根据培基的大小来选取。优选地，所述根状茎的接种量为8～15条或8～15块。优选地，所述培养的条件为在荧光灯照射下培养50～60d，培养温度为24～27℃，光照强度为900～2100lx，光照时间为11～13h·d-1。光照条件可通过荧光灯实现。增殖和分化的培养条件均可按此进行。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明研究发现，在常规的培养基中添加适宜浓度的硫酸铜，能显著提高国兰根状茎增殖率和分化率，显著提高国兰工厂化繁殖的效率，为“玉香兰”新品种推广和国兰产业化发展奠定技术基础。另外，该方法无需改变生产程序，几乎不增加成本，可显著提高国兰种苗工厂化生产效率，对建立国兰高效工厂化生产技术体系，推动国兰产业化发展有重要现实意义。附图说明图1为附加不同浓度硫酸铜的“玉香兰”根状茎增殖效果；图2为附加不同浓度硫酸铜的“玉香兰”根状茎分化培养50d后的芽苗；图3为硫酸铜对“达摩墨兰”根状茎增殖的影响。具体实施方式下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。实施例1培养基中附加硫酸铜促进“玉香兰”根状茎增殖和分化为了寻找提高“玉香兰”根状茎增殖和分化效率的方法，研究了硫酸铜对“玉香兰”根状茎增殖和分化的影响。具体方法如下：S1.培养基设计和配制包括以下步骤：S11.培养基设计：基本增殖培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+AC0.5g·L-1+蔗糖30.0g·L-1+卡拉胶7.0g·L-1pH＝5.8±0.2，在此培养基中分别添加0、2、4和6mg·L-1硫酸铜进行增殖试验。基本分化培养基为MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+蔗糖30.0g·L-1+AC0.05g·L-1+卡拉胶7.0g·L-1pH＝5.8±0.2，在此培养基中分别添加0、2、4和6mg·L-1硫酸铜进行分化试验。S12.培养配制和灭菌：配制好2.0mg·L-1硫酸铜溶液，根据设计的培养基配方，先吸取母液和硫酸铜溶液，然后称取卡拉胶和蔗糖，接着用500mL去离子水将卡拉胶煮熔，加入蔗糖、母液，定容到1L，调pH至5.8，将配置好的培养基分装到培养瓶中，每瓶30mL，并放入高压灭菌锅中在121℃下灭菌20分钟，取出冷却后待用。S2.根状茎的选择、切割和接种包括以下步骤：S21.根状茎选择和切割：选择生长良好的根状茎，去除褐化坏死组织，用无菌解剖刀将其切成约1cm长.用于增殖培养的根状茎切除根状茎顶端，而用于分化的根状茎保留顶端。S22.接种：将切除顶端的根状茎接种到继代培养基上，每瓶接15条，记录重量的重量；将未切除顶端的根状茎接种到分化培养基上，每瓶接15条、不称重。S3.培养和观测包括以下步骤：S31.增殖培养与观测：将接种好的增殖培养的材料放在培养室中在荧光灯下培养，培养温度为26±1℃，光照强度为2000±100lx，光照时间为12h·d-1，培养过程中观察并记录根状茎生长情况，50d后，称其鲜重，按下述公式计算褐化死亡率和增殖系数。褐化死亡率％＝褐化死亡根状茎质量接种根状茎质量；增殖系数＝接种终鲜重接种始鲜重。S32.分化培养与观测：将接种好的分化培养的材料放在培养室中在荧光灯下培养，培养温度为26±1℃，光照强度为2000±100lx，光照时间为12h·d-1，培养过程中观察并记录根状茎分化情况，50d后，记录分化出的芽数、有芽根状茎数、根数和有根根状茎数，按下述公式计算芽分化率、根分化率和根分化数。芽分化率％＝分化处出芽的根状茎数接种的根状茎数；芽分化数个条＝分化出的芽数接种的根状茎数；根分化率％＝分化处出根的根状茎数接种的根状茎数；根分化数根条＝分化出的根数接种的根状茎数。增殖结果如图1a.CuSO40.00mg·L-1；b.CuSO42.00mg·L-1；c.CuSO44.00mg·L-1；d.CuSO46.00mg·L-1和表1。由表1可以看出，培养基中加入硫酸铜对“玉香兰”根状茎增殖有显著影响，培养基中加入2mg·L-1硫酸铜，“玉香兰”增殖系数最高，为2.55。表1CuSO4对“玉香兰”根状茎增殖的影响分化结果如图2a.CuSO40.00mg·L-1；b.CuSO42.00mg·L-1；c.CuSO44.00mg·L-1；d.CuSO46.00mg·L-1和表2。由表2可以看出CuSO4对“玉香兰”分化培养影响显著，随着Cu2+浓度的增加，“玉香兰”的芽分化率、芽分化数、根分化率和根分化数都呈逐渐升高的趋势。6.00mg·L-1Cu2+的芽分化率和根分化率均最高，均为85.63％。表2CuSO4对“玉香兰”根状茎分化培养的影响实施例2培养基中附加硫酸铜促进“达摩墨兰”根状茎增殖和分化为了寻找提高“达摩墨兰”根状茎增殖和分化效率的方法，研究了硫酸铜对“达摩墨兰”根状茎增殖和分化的影响。具体方法如下：S1.培养基设计和配制包括以下步骤：S11.培养基设计：基本增殖培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+AC0.3g·L-1+蔗糖30.0g·L-1+卡拉胶7.0g·L-1pH＝5.8±0.2，在此培养基中分别添加0、2、4和6mg·L-1硫酸铜进行增殖试验。基本分化培养基为MS+6-BA3.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+蔗糖30.0g·L-1+卡拉胶7.0g·L-1pH＝5.8±0.2，在此培养基中分别添加0、2、4mg·L-1硫酸铜进行分化试验。S12.培养配制和灭菌：配制好2.0mg·L-1硫酸铜溶液，根据设计的培养基配方，先吸取母液和硫酸铜溶液，然后称取卡拉胶和蔗糖，接着用500mL去离子水将卡拉胶煮熔，加入蔗糖、母液，定容到1L，调pH至5.8，将配置好的培养基分装到培养瓶中，每瓶30mL，并放入高压灭菌锅中在121℃下灭菌20分钟，取出冷却后待用。S2.根状茎的选择、切割和接种包括以下步骤：S21.根状茎选择和切割：选择生长良好的根状茎，去除褐化坏死组织，用无菌解剖刀将其切大小均匀、有2-3条根状茎的根状茎块.用于增殖培养的根状茎切除根状茎顶端，而用于分化的根状茎保留顶端。S22.接种：将切除顶端的根状茎接种到继代培养基上，每瓶接8块，记录重量；将未切除顶端的根状茎接种到分化培养基上，每瓶接10块、记录称重。S3.培养和观测包括以下步骤：S31.增殖培养与观测：将接种好的增殖培养的材料放在培养室中在荧光灯下培养，培养温度为25±1℃，光照强度为1000±100lx，光照时间为12h·d-1，培养过程中观察并记录根状茎生长情况，40d后，称其鲜重，按下述公式计算褐化死亡率和绝对增殖率。绝对增殖率％＝培养末鲜重－接种始鲜重接种始鲜重×100；褐变死亡率％＝褐变死亡重量接种始鲜重×100。S32.分化培养与观测：将接种好的分化培养的材料放在培养室中在荧光灯下培养，培养温度为25±1℃，光照强度为1000±100lx，光照时间为12h·d-1，培养过程中观察并记录根状茎分化情况，60d后，记录分化出的芽数、有芽根状茎数、苗数、根数，按下列公式计算芽分化率、芽分化数、根分化率和根分化数。平均芽苗分化数个·g-1＝芽分化总个数接种始鲜重；成苗率％＝分化苗数分化总芽苗数×100芽分化阶段；平均生根数条株＝总根数分化出的总苗数。由表3可以看出，培养基中添加CuSO4对“达摩墨兰”根状茎增殖的影响显著，添加4mg·L-1CuSO4绝对增殖率最高，为225.08％，增殖形成的根状茎长势好，死亡率低图3，a.CuSO40mg·L-1；b.CuSO42mg·L-1；c.CuSO44mg·L-1；d.CuSO46mg·L-1。表3CuSO4对“达摩墨兰”根状茎增殖的影响由表4可以看出，培养基中添加CuSO4对“达摩墨兰”根状茎分化的影响显著，添加2mg·L-1CuSO4平均芽苗分化数为22.4个，成苗率为25.42％。表4硫酸铜对“达摩墨兰”根状茎分化的影响以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：将根状茎接种至培养基上，培养，即可；所述培养基中添加有2～6mg·L-1的硫酸铜。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述根状茎为无污染、活力高的根状茎；所述根状茎的长度为0.8～1.2cm；所述根状茎用于增殖培养时切除顶端；所述根状茎用于分化培养时保留顶端。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养基在接种前进行灭菌操作。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述灭菌操作的过程如下：将培养基于120～125℃下灭菌20～30分钟。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养基为增殖培养基或分化培养基；所述增殖培养基为MS培养基，所述增殖培养基中还添加有6-BA1.0～2.0mg·L-1，NAA0.2～0.5mg·L-1，AC0.3～0.5g·L-1，蔗糖30g·L-1，卡拉胶7.0～8.0g·L-1；所述分化培养基为MS培养基，所述分化培养基中还添加有6-BA1.5～3.0mg·L-1，NAA0.1～0.5mg·L-1，蔗糖30.0g·L-1，AC0～0.05g·L-1和卡拉胶7.0～8.0g·L-1。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述增殖培养基中6-BA的添加量为1.0mg·L-1，NAA的添加量为0.5mg·L-1，AC的添加量为0.5g·L-1，蔗糖的添加量为30.0g·L-1，卡拉胶的添加量为7.0g·L-1，pH为5.8±0.2；所述分化培养基中6-BA的添加量为1.5mg·L-1，NAA的添加量为0.5mg·L-1+蔗糖的添加量为30.0g·L-1，AC的添加量为0.05g·L-1，卡拉胶的添加量为7.0g·L-1，pH为5.8±0.2。7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述增殖培养基中硫酸铜的添加量为2～4mg·L-1；所述分化培养基中硫酸铜的添加量为4～6mg·L-1。8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述增殖培养基或分化培养基通过如下过程制备得到：吸取MS培养基的大量、微量、铁盐、维生素以及6-BA、NAA和硫酸铜母液放入烧杯中待用；将卡拉胶用水煮熔，加入蔗糖、母液和AC后定容，调节pH即得。9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述根状茎的接种量为8～15条或8～15块。10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养的条件为在荧光灯照射下培养50～60d，培养温度为24～27℃，光照强度为900～2100lx，光照时间为11～13h·d-1。

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