申请/专利权人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

申请日：2018-12-21

公开（公告）日：2022-04-22

公开（公告）号：CN109593761B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N1/21;A61K39/10;A61P31/04;C12R1/01

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.04.22#授权;2019.05.03#实质审查的生效;2019.04.09#公开

摘要：本发明公开了一种与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用。本发明应用Northernblot证明在布鲁氏菌强毒株M28中存在sRNAClu7，利用同源重组的方法，构建了该sRNA缺失株M28ΔClu7，以鼠巨噬细胞RAW264.7和Balbc小鼠为模型评估了该sRNA对M28毒力的影响。结果显示该sRNA缺失后能显著下调强毒株M28在鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠脾脏内复制生存的能力。在接种第5周时，M28ΔClu7从小鼠体内完全清除，与M28相比毒力显著下降。小鼠攻毒保护实验显示：免疫M28ΔClu7对小鼠抵抗强毒M28感染的保护效果达到了疫苗株M5‑90的保护力。以上结果预示着sRNAClu7对布鲁氏菌的毒力有巨大的决定作用。本发明的提出对揭示布鲁氏菌毒力机制起到了巨大的推动作用。为布鲁氏菌新候选疫苗株的研发提供了新的技术手段。

主权项：1.一种与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA，命名为sRNAClu7，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：一种与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用技术领域本发明涉及一种与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA，还涉及该smallRNA在制备弱毒布鲁氏菌中的应用。本发明属于生物技术领域。背景技术布鲁氏菌病brucellosis，简称布病，是由布鲁氏菌Brucella引起的一种人兽共患慢性细菌传染病，广泛分布于世界各地，我国也是布病严重流行地区，动物和人的每年新发病例世界居首。布病给我国人民健康和农业养殖造成了巨大的损害。人感染布鲁氏菌后表现为波状热、心内膜炎和关节炎等症状，动物感染后能导致流产等。与肠道致病菌不同，布鲁氏菌毒力并不依赖于表达特异的毒力因子，而是依赖于其在宿主细胞内复制生存的能力。动物布病除海南省以外均有流行，三北地区呈严重流行，目前Ⅰ类地区已实开始对动物实行免疫接种。我国近5年人新发病例均达6万人以上。布鲁氏菌具有潜在的生物安全隐患，美国疾病预防控制中心将其定义为“B类生物恐怖主义药剂”。布鲁氏菌属于α变形菌门，革兰氏阴性菌，布鲁氏菌为胞内寄生菌，生长缓慢，并可躲避宿主的免疫系统而潜伏生长于巨噬细胞。揭示布鲁氏菌的毒力及其致病机制是长久以来科研人员的探索方向。强弱毒株的最主要特征是强毒株可以一直潜伏感染，而弱毒株经过一段时间可以在体内清除。细菌具有多种调节机制，其中具有调控功能的RNA被认为是其固有调节机制的重要组成部分，如smallRNAsRNA等。细菌sRNA是一类具有调控功能的非编码小RNA，大部分位于编码基因间区，长度在50～500nt之间，在细菌生命活动中发挥着广泛的调控作用，如调控铁代谢、糖代谢、细菌毒力、信号传递、群体感应等。至今发现的大部分sRNA位于细菌染色体上，部分位于染色体外遗传物质如转座子、质粒等。布鲁氏菌能够感染人或多种动物牛、羊、猪、狗等，体外培养时可以感染包括巨噬细胞、网状内皮细胞等多种细胞，这种多宿主特性可能与sRNA调控相关。根据推测，布鲁氏菌理论上应该有100～200个sRNA，目前只被鉴定出AbsR1和AbsR2两个sRNA，研究相对较少。本发明发明人鉴定出一个可决定布鲁氏菌毒力的smallRNAsRNA，填补了布鲁氏菌sRNA研究方面的不足，对揭示布鲁氏菌毒力机制起到了巨大的推动作用，同时对布鲁氏菌新候选疫苗株的研发提供了新的技术手段，具有广阔的应用前景。发明内容本发明的目的之一在于提供一种新型的与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用。本发明的目的之二在于提供一种弱毒布鲁氏菌及其构建方法。本发明的目的之三在于提供所述的弱毒布鲁氏菌在制备布鲁氏菌弱毒疫苗中的用途。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明发明人鉴定出一个可决定布鲁氏菌毒力的smallRNAsRNA，命名为sRNAClu7。本发明应用Northernblot证明在布鲁氏菌强毒株M28中存在sRNAClu7，利用同源重组的方法，构建了该sRNA缺失株M28ΔClu7，以鼠巨噬细胞RAW264.7和Balbc小鼠为模型评估了该sRNA对M28毒力的影响。结果显示该sRNA缺失后能显著下调强毒株M28在鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠脾脏内复制生存的能力。在接种第5周时，M28ΔClu7从小鼠体内完全清除，与M28相比毒力显著下降。小鼠攻毒保护实验显示：免疫M28ΔClu7对小鼠抵抗强毒M28感染的保护效果达到了疫苗株M5-90的保护力。以上结果预示着sRNAClu7对布鲁氏菌的毒力有巨大的决定作用和作为疫苗潜力。因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA，命名为sRNAClu7，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，本发明还提出了所述的与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA在布鲁氏菌毒力评价中的应用。以及所述的与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA在制备弱毒布鲁氏菌中的应用。一种弱毒布鲁氏菌，其特征在于，所述的布鲁氏菌的基因组中不含有编码上述的与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA的序列。其中，优选的，所述的弱毒布鲁氏菌是通过以下方法制备得到：1合成用于构建所述的弱毒布鲁氏菌的引物：Clu7_L-F：5’GGTGACACTATAGAACTCGAGAGAGCGAGGGCAAACGCC3’Clu7_L-R：5’AGATATGAAGACCCATTACCGACAG3’Clu7_K-F：5’GGTAATGGGTCTTCATATCTTTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA3’Clu7_K-R：5’CCATCGGTCATCATCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC3’Clu7_R-F：5’CTTCTGATGATGACCGATGGCACCG3’Clu7_R-R：5’TATAGGGAGACCGGCAGATCTGCTTCTCAGCGTGCTTGAAGA3’Clu7YL_F：5’TTCGCTGGCATAGGCATTGGCTCTC3’Clu7YL_R：5’CCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCC3’Clu7YR_F：5’CCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGA3’Clu7YR_R：5’ATGAAGTGCGCTATGAGGGCCGTGG3’2自杀质粒的构建以布鲁氏菌M28基因组DNA为模板，使用引物Clu7_L-F、Clu7_L-R和Clu7_R-F、Clu7_R-R分别PCR扩增Clu7基因的N端、C端同源臂；以pBlue-Kan为模板，使用引物Clu7_K-F和Clu7_K-R扩增Kanr表达盒；用XhoI和BglⅡ双酶切pSP72载体，切胶回收以上三段目的片段，连接产物转化至感受态细胞中，涂布Kanr抗性平板，筛选阳性克隆，得到的阳性克隆命名为pSP72-ΔClu7-k；3自杀质粒的电击转化及Clu7基因缺失株的鉴定筛选将pSP72-ΔClu7-k电转化入布鲁氏菌M28感受态细胞中，筛选得到的只有卡那抗性的阳性克隆，对筛选到的候选缺失株划线传代检测其稳定性，利用引物Clu7YL_F、Clu7YL_R和Clu7YR_F、Clu7YR_R分别从基因组两侧向kan抗性基因扩增，完成PCR鉴定，并进一步测序鉴定，选取阳性菌株扩大培养后保存得到弱毒布鲁氏菌，命名为M28ΔClu7。更进一步的，本发明还提出了所述的弱毒布鲁氏菌在制备布鲁氏菌弱毒疫苗中的应用。相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明通过研究发现sRNAClu7基因具有巨大的毒力决定作用，缺失该基因的M28ΔClu7毒株在免疫后5周，完全从小鼠体内清除，这与亲本株M28有着本质上的区别。与病毒相比较，布鲁氏菌有着巨大的基因组约350万bp，其适应环境的能力远远强于病毒，单独基因的缺失导致的功能丧失，可能会有其他的代偿机制或者冗余机制来补充，因此，利用缺失单基因来改造细菌，获得弱毒株是一件及其困难的工作。clu7的发现实现了这一目标，从本发明的研究结果可以看出，M28在第5周在小鼠脾脏的细菌含量约为4.7Log10，而M28ΔClu7此时为0，这种巨大的变化对于揭示布鲁氏菌胞内存活机制具有重要的意义。本发明证实sRNAclu7缺失后能够显著下调布鲁氏菌的毒力，将有助于理解布鲁氏菌的致病机理，并且为布鲁氏菌新候选疫苗株的研发提供新的技术手段。附图说明图1为Northernblot验证布鲁氏菌M28sRNAClu7；图2为自杀质粒的构建与鉴定；A：pSP72-ΔClu7-k质粒的构建；M：DNAMarkerDL5000，L：Clu7左同源臂，K：kan基因，R：右同源臂；B：pSP72-ΔClu7-k质粒的PCR鉴定；M：DNAMarkerDL5000，1：插入序列的全长扩增；图3为M28ΔClu7缺失株的PCR鉴定；M：DNAMarkerDL5000，YL：左同源臂，YR：M28；图4为Clu7影响布鲁氏菌胞内存活能力**：P中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）一种与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用KLPI18096012PatentInversion3.31163DNAClu71aacccttttggaagccgttgcctgtcggtaatgggtcttcatatctgccattgggcgaaa60gtgccgcagtttcgataatcaaagctgcgcttttctccccagactttcaggattgagaag120atgaaagccaatatccatcccgactaccacaccatcaaggtcg163239DNAartificialsequence2ggtgacactatagaactcgagagagcgagggcaaacgcc39325DNAartificialsequence3agatatgaagacccattaccgacag25445DNAartificialsequence4ggtaatgggtcttcatatctttcaaatatgtatccgctcatgaga45536DNAartificialsequence5ccatcggtcatcatcagaagaactcgtcaagaaggc36625DNAartificialsequence6cttctgatgatgaccgatggcaccg25742DNAartificialsequence7tatagggagaccggcagatctgcttctcagcgtgcttgaaga42825DNAartificialsequence8ttcgctggcataggcattggctctc25925DNAartificialsequence9ccagccggccacagtcgatgaatcc251025DNAartificialsequence10ccgacctgtccggtgccctgaatga251125DNAartificialsequence11atgaagtgcgctatgagggccgtgg251257DNAartificialsequence12ctcaatcctgaaagtctggggagaaaagcgcagctttgattatcgaaactgcggcac57

权利要求：1.一种与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA，命名为sRNAClu7，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA在布鲁氏菌毒力评价中的应用。3.权利要求1所述的与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA在制备弱毒布鲁氏菌中的应用。4.一种弱毒布鲁氏菌，其特征在于，所述的布鲁氏菌的基因组中不含有编码权利要求1所述的与布鲁氏菌毒力相关的smallRNA的序列。5.如权利要求4所述的弱毒布鲁氏菌，其特征在于，通过以下方法制备得到：1合成用于构建所述的弱毒布鲁氏菌的引物：Clu7_L-F：5’GGTGACACTATAGAACTCGAGAGAGCGAGGGCAAACGCC3’Clu7_L-R：5’AGATATGAAGACCCATTACCGACAG3’Clu7_K-F：5’GGTAATGGGTCTTCATATCTTTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA3’Clu7_K-R：5’CCATCGGTCATCATCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC3’Clu7_R-F：5’CTTCTGATGATGACCGATGGCACCG3’Clu7_R-R：5’TATAGGGAGACCGGCAGATCTGCTTCTCAGCGTGCTTGAAGA3’Clu7YL_F：5’TTCGCTGGCATAGGCATTGGCTCTC3’Clu7YL_R：5’CCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCC3’Clu7YR_F：5’CCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGA3’Clu7YR_R：5’ATGAAGTGCGCTATGAGGGCCGTGG3’2自杀质粒的构建以布鲁氏菌M28基因组DNA为模板，使用引物Clu7_L-F、Clu7_L-R和Clu7_R-F、Clu7_R-R分别PCR扩增Clu7基因的N端、C端同源臂；以pBlue-Kan为模板，使用引物Clu7_K-F和Clu7_K-R扩增Kanr表达盒；用XhoI和BglⅡ双酶切pSP72载体，切胶回收以上三段目的片段，连接产物转化至感受态细胞中，涂布Kanr抗性平板，筛选阳性克隆，得到的阳性克隆命名为pSP72-ΔClu7-k；3自杀质粒的电击转化及Clu7基因缺失株的鉴定筛选将pSP72-ΔClu7-k电转化入布鲁氏菌M28感受态细胞中，筛选得到的只有卡那抗性的阳性克隆，对筛选到的候选缺失株划线传代检测其稳定性，利用引物Clu7YL_F、Clu7YL_R和Clu7YR_F、Clu7YR_R分别从基因组两侧向kan抗性基因扩增，完成PCR鉴定，并进一步测序鉴定，选取阳性菌株扩大培养后保存得到弱毒布鲁氏菌，命名为M28ΔClu7。6.权利要求4或5所述的弱毒布鲁氏菌在制备布鲁氏菌弱毒疫苗中的应用。

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