申请/专利权人：白帆生物科技(上海)有限公司

申请日：2023-07-14

公开（公告）日：2023-10-27

公开（公告）号：CN116948946A

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;G01N21/64;C12N5/09;C12Q1/02;G01N33/68

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.11.14#实质审查的生效;2023.10.27#公开

摘要：本发明涉及生物制药技术相关领域，具体为一种精准测量NGF蛋白相对细胞活性的方法，本发明通过能科学重复出能测试NGF生物细胞活性的分析测试方法；不需要特定的人源或者鼠源的NGF蛋白，只要具有NGF靶点都能测试；用四参数拟合曲线的方式规定了结合活性的上限和下限，科学的指出结合活性的线性范围，并且符合药典和法规的要求，为生物药物的分析提供了可能；显色温度为25℃，在室温下就可完成反应，不需要另外的加热元件；检测方法的R2≥0.95，样品复孔CV控制在30％以内，精准和重复性很高，符合药物的中国、美国等国家的药物活性测试标准。

主权项：1.一种精准测量NGF蛋白相对细胞活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、选用处于对数生长期的CHOTrkA细胞；步骤S2、将步骤S1中CHOTrkA细胞旧培养基去除，用无菌DPBS润洗细胞1-2遍；步骤S3、向步骤S2中润洗后的CHOTrkA细胞的培养瓶中加入2ml的0.25％胰酶-EDTA，摇晃均匀，放回37℃培养箱内孵育1-2min，至CHOTrkA细胞开始变圆；步骤S4、加入8mlCHOTrkA细胞完全培养基终止消化，用移液器吹打细胞，使细胞分散混匀；步骤S5、收集步骤S4中细胞分散混匀的CHOTrkA细胞液至15ml离心管，取200g离心5min，然后弃去上清液，用适量CHOTrkA细胞分析培养基重悬细胞；步骤S6、取适量CHOTrkA细胞悬液至1.5ml离心管进行细胞计数；步骤S7、根据供试品数量统计所需的黑色96孔培养板数目，计算所需CHOTrkA细胞悬液体积，然后用CHOTrkA细胞分析培养基将CHOTrkA细胞悬液中细胞密度调整至8×104个ml，将调整后的CHOTrkA细胞悬液加入黑色96孔板的板孔中，样品孔每孔加入128μl的CHOTrkA细胞悬液，即每孔约10000个细胞，Cell-freewells每孔加入128μlCHOTrkA细胞分析培养基，96孔板剩余空白孔加入200μl无菌PBS或CHOTrkA细胞分析培养基；步骤S8、将步骤S7中配置好的黑色96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱内孵育16h～20h；步骤S9、选用透明96孔板、供试品和参比品，在透明96孔板中进行双复孔梯度稀释；步骤S10、将步骤S9中倍比、双复孔稀释好的参比品和供试品转至黑色96孔板培养板板孔内，每孔32μl，Cell-freewells每孔加32μl样品稀释液，轻轻拍板，混合均匀，将黑色96孔板培养板置于37℃、5％CO2培养箱内进行孵育5h；步骤S11、将6μl溶液A加入到60μl溶液B中混合得到AB混合液；再将874μl溶液C和60μl溶液D加入到AB混合液中，混合均匀得到底物混合液；将黑色96孔板培养板从细胞培养箱中取出，平衡至室温，黑色96孔板培养板的每孔加入32μl底物混合液，拍板使混合均匀，于微孔板恒温振荡器避光封闭25℃孵育2h，随后使用酶标仪读取荧光值。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 白帆生物科技(上海)有限公司 一种精准测量NGF蛋白相对细胞活性的方法

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