申请/专利权人：中国环境科学研究院

申请日：2023-08-17

公开（公告）日：2023-12-26

公开（公告）号：CN117288919A

主分类号：G01N33/24

分类号：G01N33/24;G01N1/28

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.02.27#实质审查的生效;2023.12.26#公开

摘要：本发明公开了一种土壤重金属对秀丽隐杆线虫毒性影响的测试方法，涉及土壤污染评价技术领域，包括以下步骤：S1、NGM培养基制备；S2、线虫培养；S3、污染土壤制备；S4、污染环境模拟；S5、毒性测试；S6、数据分析：S6‑1、线虫生长量分析；S6‑2、线虫生育率分析；S6‑3、线虫繁殖力分析；S6‑4、剂量‑效应关系。本发明针对现有的沉积物和土壤对线虫的毒性测试标准方法比较笼统的问题，提出一种更为具体详尽的、可操作性更强的线虫毒性实验方法，通过相关性分析，得到影响线虫毒性阈值与土壤性质的相关关系，基于土壤性质，通过线性回归分析构建土壤重金属对线虫的毒性预测模型，为土壤中重金属对秀丽隐杆线虫毒性影响提供理论基础。

主权项：1.一种土壤中重金属对秀丽隐杆线虫毒性影响的测试方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、NGM培养基制备：按重量份计，称取2～3份酪蛋白胨、15～20份琼脂、28～30份NaCl、1～2份胆固醇储备液、1～2份摩尔浓度为1molL的CaCl2溶液、1～2份摩尔浓度为1molL的MgSO4溶液、22～26份摩尔浓度为1molL的KH2PO4溶液，使用去离子水定容至1000份，随后在120℃下灭菌处理30min，在玻璃器皿中等待凝固1～2h，得到NGM培养基；S2、线虫培养：按重量份计，称取600～650份大肠杆菌菌液滴加在装有100～150份NGM培养基的NGM平板上，自然风干后，向其中加入线虫幼虫，在温度为20±2℃的避光黑暗条件下的恒温气候培养箱中培养72h，随后使用M9缓冲液冲洗NGM平板将NGM培养基表面的线虫幼虫冲洗至离心管中，使用1200目的尼龙滤网对离心管中的溶液进行过滤，得到含有L1期线虫幼虫的缓冲液；S3、污染土壤制备：称取无重金属污染的农田土壤，使用分析纯重金属化合物作为外源污染物，以盐溶液的形式将重金属或类金属离子添加至农田土壤中混合均匀，得到重金属质量浓度范围为0～3000mgkg的实验土壤，在上述质量浓度范围内设置9个梯度浓度的实验土壤作为实验组，同时设置1个无污染的对照组，每个实验组或对照组设置3个平行组，将实验土壤静置7天后，自然风干，过2mm筛备用；S4、污染环境模拟：将步骤S3中的各个实验组和对照组置于24孔板中，加入量为5重量份，向每个孔板中加入M9缓冲液使孔板中的实验土壤含水量为70～80％，压实每个孔板中的实验土壤，再向每个孔板中加入1重量份的大肠杆菌重悬液，使用细菌封口膜将孔板密封，将24孔板置于20±2℃的避光黑暗条件的恒温气候培养箱中，静置3～4h，随后使用点样毛细管吸取步骤S2中得到的L1期线虫幼虫，向每个孔板中加入10条L1期线虫幼虫，加入后使用细菌封口膜将孔板密封，将24孔板置于20±2℃的避光黑暗条件的恒温气候培养箱中，静置90～100h；S5、毒性测试：向各个孔板中加入20重量份的Ludox悬浮稀释液，反复加入3次，将孔板中实验土壤内线虫冲洗出来，随后将冲洗用的60重量份Ludox悬浮稀释液转移至装有3重量份孟加拉玫瑰红原液的离心管中，将离心管放入70～75℃烘箱中，加热20～30min，杀死线虫，再将离心管在4000～5000rpm的离心转速下离心处理5～6min，得到线虫回收液，将线虫回收液倒入12孔板中，在100倍显微镜下测定线虫的体长，在40倍显微镜下测定线虫的妊娠和后代个数；S6、数据分析：采用Excel、SPSS24.0对步骤S5毒性测试的线虫的生长量、生育率、繁殖力进行相关性统计分析，采用Origin2019b、SigmaPlot12.5进行各个重金属质量浓度与线虫的剂量-效应关系拟合与图像绘制；S6-1、线虫生长量分析：LG＝LF-L0式中，LG为线虫生长量，单位为μm；LF为毒性测试结束时的线虫体长，单位为μm；L0为线虫初始体长，单位为μm；S6-2、线虫生育率分析：B＝NFNI×100％式中，B为线虫的生育率，单位为％；NF为具有生育能力的线虫个体数量，单位为条；NI为污染环境模拟中的线虫个体数量，单位为条；S6-3、线虫繁殖力分析：R＝NDNI×100％式中，R为线虫的繁殖力，单位为条；ND为线虫后代个体数量，单位为条；NI为引入试验的线虫个体数量，单位为条；S6-4、剂量-效应关系：采用Logistic方程拟合实验土壤的各个重金属质量浓度与线虫之间的剂量-效应关系并计算EC50： 式中，y为实验组中线虫的生长量或生育率或繁殖力；x为实验土壤的各个重金属质量浓度；a为对照组中线虫的生长量或生育率或繁殖力；x0为EC50值；b为方程拟合过程中所产生的斜率参数。

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权利要求：

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