申请/专利权人：湖南师范大学

申请日：2023-09-27

公开（公告）日：2024-02-09

公开（公告）号：CN117535346A

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/113;C12N9/22;A01K67/0276;C12N15/12;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.03.01#实质审查的生效;2024.02.09#公开

摘要：本发明公开了一种同源四倍体鲫的同源基因敲除方法，其步骤包括：1同源四倍体鲫倍性验证；2目的基因序列的获得和同源基因的区分；3同源基因敲除靶点的选择与亲本纯合性的检验；4guideRNA的体外转录、纯化与体外活性验证；5同源四倍体鲫的单个同源基因和多个同源基因敲除的显微注射。本发明针对同源四倍体鲫的遗传特性，应用CRISPRcas9基因编辑技术对其进行基因敲除，成功获得了体色变异突变体，还公开了体色变异或性腺发育快的同源四倍体鲫的制备方法。这为同源四倍体鲫在同源多倍化后的遗传变异、性状改良和性状的可控选育提供了重要手段，同时也为同源多倍体生物的遗传和育种提供重要见解。

主权项：1.一种同源四倍体鲫的同源基因敲除方法，其特征在于，包括如下步骤：1根据同源四倍体鲫的基因组序列，设计要敲除的目的基因的CDS全长和DNA特异扩增引物，分别以目的基因特异性表达组织的cDNA和DNA为模板，使用TaKaRaLA完成目的基因CDS和DNA的PCR全长扩增，并以pMD19-T为载体进行单克隆序列检测，获得目的基因准确CDS和DNA序列全长，然后对所有同源基因测序结果进行序列比对和分析，确定各同源基因的SNP位点；2根据步骤1中获得的目的基因准确CDS序列以及各同源基因序列SNP位点，在各同源基因特异靶点前后区域设计特异性PCR扩增引物；然后以同源四倍体鲫的血液DNA为模板，完成各同源基因特异靶点区域的PCR扩增和测序，筛选出Sanger测序结果显示亲本靶点处序列无任何突变、峰图显示为单峰的合格亲鱼分开饲养备用；3根据步骤2中的靶点序列合成通用引物链和靶点引物链，进行PCR扩增反应、PCR产物回收，然后以PCR回收产物为模板进行体外转录；同时，以PCR回收产物为模板配置靶点体外活性体系，筛选切割效率超过50％的gRNA为体外活性验证合格的sgRNAs；4采用人工干法授精，在体式显微镜下观察同源四倍体鲫受精卵，将所述体外活性验证合格的sgRNAs和cas9混匀注射至优质受精卵的一细胞期动物极，采取多次受精多次注射的方法，注射剂量为同源四倍体鲫受精卵体积的八分之一；5将所有注射胚胎置于纯水中发育，受精卵发育至36h后按照步骤3的反应条件进行靶点区域处的PCR扩增，检测突变效率，筛选合格的突变体。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 湖南师范大学 一种同源四倍体鲫的同源基因敲除方法及其应用

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