申请/专利权人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所

申请日：2020-06-01

公开（公告）日：2024-02-23

公开（公告）号：CN113755611B

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/682;C12Q1/04;C12R1/46

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.23#授权;2022.02.08#实质审查的生效;2021.12.07#公开

摘要：本发明提供了一种检测细菌核酸的方法、芯片及在龋齿检测中应用，具体为S1：将探针、扩增试剂、待测菌、显色试剂离心混匀；所述探针为具有茎环结构的发夹探针，由三个片段组成：1在3'末端设计形成G‑四链体的序列，2在5'末端的9个碱基能够与部分G‑四链体序列互补配对，阻碍G‑四链体的形成，3一个环状区域。S2：进行扩增反应；S3：通过比色反应对16SrRNA进行定量化检测。本发明将离心式微流控芯片与基于双链特异性核酸酶辅助的靶循环和探针切割的比色法结合，用于灵敏地检测和辨别龋齿中变异链球菌和远缘链球菌。

主权项：1.一种非诊断目的的检测细菌核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将探针、扩增试剂、待测菌的RNA、显色试剂离心混匀；所述探针为具有茎环结构的发夹探针，由三个片段组成：（1）3'末端设计能够形成G-四链体的序列，（2）在5'末端的9个碱基能够与3'末端部分G-四链体序列互补配对，阻碍G-四链体的形成，（3）一个环状区域；其中，所述扩增试剂为双链特异性核酸酶及其缓冲溶液；且显色试剂包括血红素、过氧化氢和ABTS；S2：进行等温扩增反应；其中，当靶16SrRNA存在时，发夹探针与靶16SrRNA杂交形成探针-靶16SrRNA双链体，其探针链被双链特异性核酸酶识别及消化，从而释放靶16SrRNA并且产生富G的片段；释放的靶16SrRNA可以与新的发夹探针杂交形成新的探针-靶16SrRNA双链体，引发多个发夹探针链的循环消化从而实现富G片段的扩增；然后产生的富G片段在血红素的作用下形成具有催化作用的G-四链体，通过过氧化氢和ABTS在G-四链体催化作用下发生氧化还原反应，最终ABTS被氧化成ABTS+，产生明显的肉眼可见的绿色信号；S3：通过比色反应对细菌中的16SrRNA进行可视化检测，通过颜色深浅来判断细菌中16SrRNA含量的高低；且所述方法采用微流控芯片进行，所述芯片包括至少1个反应单元，所述检测单元包括第一进样口、第二进样口、第三进样口、混合通道和反应室，所述第一进样口和第二进样口靠近圆心，所述反应室位于芯片边缘，所述第一进样口和第二进样口与混合通道的一端相连，混合通道的另一端与反应室相连，反应室与第三通道进样口相连；其中，在第一进样口加入所述探针和扩增试剂，在第二进样口加入所述待测菌的RNA，在第三进样口加入显色试剂，通过混合通道进入反应室进行等温扩增反应。

全文数据：

权利要求：

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