申请/专利权人：安徽师范大学

申请日：2023-11-21

公开（公告）日：2024-03-05

公开（公告）号：CN117646024A

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;C12N15/64;C12N15/66;C12N15/113;C12N15/55;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/20

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.03.22#实质审查的生效;2024.03.05#公开

摘要：本发明公开了一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，1入门载体的构建：以质粒RS300为模板，通过PCR扩增反应获得包含靶点、BsaI内切酶识别和切割位点的DNA片段，通过酶切连接反应获得完整入门载体；2通过LR反应进行表达载体的构建：利用gateway体系构建表达载体，利用LR酶将入门载体与含有启动子的表达载体进行LR反应从而获得完整表达载体；3将步骤2获得的表达载体转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行酶切鉴定；4酶切鉴定后进行转基因操作直至获取转基因植株阳性苗。本申请在构建基因敲低的表达载体时，可以将多个含有靶点的序列连接在一起同时连接进入门载体，效率较高。

主权项：1.一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于包括以下步骤：1入门载体的构建：以质粒RS300为模板，通过PCR扩增反应获得包含靶点、BsaI内切酶识别和切割位点的DNA片段，通过酶切连接反应获得完整入门载体，所用引物包括含有靶点序列的引物和位于两端的引物；2通过LR反应进行表达载体的构建：利用gateway体系构建表达载体，使用LR酶进行LR反应，电泳确定入门载体和表达载体的浓度，体系中加入入门载体和表达载体的总量比为3：1，加LR酶，25℃孵育过夜；3将步骤2获得的表达载体转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行酶切鉴定；4酶切鉴定后进行转基因操作直至获取转基因植株阳性苗。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 安徽师范大学 一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法

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