申请/专利权人：四川大学

申请日：2023-10-19

公开（公告）日：2024-03-12

公开（公告）号：CN117683914A

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12R1/42

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.19#实质审查的生效;2024.03.12#公开

摘要：本发明公开了基于PCR结合CRISPRCas13a的沙门氏菌灵敏可视化检测方法，涉及生物检测技术领域，其技术要点为：包括以下步骤：S1、寡核苷酸和crRNA制备；S2、PCR引物筛选；S3、LwaCas13a活性检测；S4、PCR‑Cas13a测定；S5、PCR‑Cas13a的灵敏度和特异性检测。本发明的方法不需要大型昂贵仪器，保证了检测的灵敏度，还节省了检测人员的检测时间，降低了工作量；同时，该方法可以避免凝胶电泳造成的气溶胶污染，并成功应用于猪场环境中分离的多血清型沙门氏菌的检测，表明该方法是一种很有前途的检测方法。

主权项：1.基于PCR结合CRISPRCas13a的沙门氏菌灵敏可视化检测方法，其特征是：包括以下步骤：S1、寡核苷酸和crRNA制备选择HilA基因作为沙门氏菌检测的靶基因；分析目的基因的核酸序列，并使用Primer-BLAST设计PCR扩增引物；根据Lwacas13a试剂盒说明书，设计3种crRNA；分别在荧光探针的5’和3’末端进行FAM和BHQ1修饰；通过T7转录试剂盒根据说明书制备crRNA；S2、PCR引物筛选分别设计两个正向引物和三个反向引物，将上游和下游引物两两配对并分别进行PCR；PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析；根据电泳结果，选择扩增产物单一且亮度高的引物对用于后续实验分析；S3、LwaCas13a活性检测将2μL10×HOLMES缓冲液、0.1μL10μMLwaCas13a核酸酶、0.1μL10μMcrRNA、0.1μL10μM靶RNA、0.5μL10μMssRNA报告基因、0.5μLRNA酶抑制剂，并添加无核糖核酸酶的水在至20μL反应体系，在37℃下进行30分钟反应，并在UV光下监测；比较在三种crRNA的指导下LwaCas13a的切割效率；基于在相同反应时间的荧光强度选择crRNA；其中，LwaCas13a活性检测系统中，靶标ssRNA、crRNA或LwaCas13a被DEPC处理的水替代并用作阴性对照；S4、PCR-LwaCas13a测定PCR正向引物附加有T7启动子序列；根据步骤S2所述进行PCR；然后，进行T7转录；然后将2μL转录产物加入到Casl3a反应体系中；最后，在UV灯观察结果；S5、PCR-LwaCas13a的灵敏度和特异性检测以不同稀释浓度的HilA基因DNA和S.Typhimurium总基因组DNA为模板，采用PCR-Cas13a方法进行检测；选择4株不同血清型的沙门氏菌，使用TIANamp细菌DNA试剂盒提取所有细菌总DNA；使用DEPC处理的水作为模板代替PCR反应体系中的靶DNA作为阴性对照。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 四川大学 基于PCR结合CRISPR Cas13a的沙门氏菌灵敏可视化检测方法

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