申请/专利权人：山东省科学院中日友好生物技术研究中心

申请日：2011-11-04

公开（公告）日：2015-01-07

公开（公告）号：CN102532325B

主分类号：C07K19/00(2006.01)I

分类号：C07K19/00(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;C07K14/435(2006.01)I;C07K14/46(2006.01)I;C07K1/12(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I;A61P31/04(2006.01)I;A23K1/16(2006.01)I;C12R1/19(2006.01)N

优先权：["2011.02.25 CN 201110045039.1"]

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2020.10.27#未缴年费专利权终止;2015.01.07#授权;2012.09.05#实质审查的生效;2012.07.04#公开

摘要：本发明公开了一种将两个不同杀菌机制的抗菌肽CAD和Buforin II融合表达以及使用羟胺切割形成两种抗菌肽复合制剂的工艺方法。利用羟胺可以专一性地切割蛋白中Asn-Gly肽键，我们在融合蛋白和附加序列His标签的连接部引入Asn-Gly位点，并用大肠杆菌表达系统高效表达上述融合蛋白，经亲和层析纯化后，获得重组的CAD-Buforin II，再使用羟胺进行切割，继续经分离纯化后获得纯化的CAD和Buforin II复合抗菌肽。本发明的融合蛋白可以作为动物饲料添加剂部分替代现有的抗生素添加剂。

主权项：一种含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白，其特征是含有天蚕素AD和蛙Buforin II两种不同抑菌机制的抗菌肽的融合蛋白；所述融合蛋白是通过人工合成CAD‑Buforin II基因、表达质粒pET‑Trx‑CAD‑Buforin II的构建、表达工程菌株大肠埃希氏菌Escherichia coliTrx‑PC6BL21的筛选、融合抗菌肽CAD‑Buforin II的大规模表达获得，融合抗菌肽CAD‑Buforin II经纯化和裂解后，制得的天蚕素AD和蛙Buforin II的复合抗菌肽溶液；所述人工合成CAD‑BuforinII基因序列是采用人工合成四对引物，通过3轮PCR，合成的天蚕素AD和蛙Buforin II融合基因，在天蚕素AD和蛙Buforin II之间以及天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白N端序列之前各引入一个羟胺位点Asn‑Gly，其序列如序列1所示；所述人工合成四对引物的序列如序列2‑9所示；所述表达质粒pET‑Trx‑CAD‑Buforin II的构建是由质粒pET‑Trx与人工合成的CAD‑Buforin II基因片段连接构成表达质粒，用BamH I和EcoR I双酶切，连接而成的质粒pET‑Trx‑CAD‑Buforin II，其N端有3个His形成立体His‑patch；所述表达工程菌株是由pET‑Trx‑CAD‑Buforin II质粒转化E.coli BL21细胞获得融合抗菌肽CAD‑Buforin II的的最高表达量的工程菌株大肠埃希氏菌Escherichia coliTrx‑PC6BL21，该菌株为已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4588；所述的融合抗菌肽CAD‑Buforin II的大规模表达是将表达菌株在LB+Amp液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日，按照体积比1∶100加入到YTA+Amp培养基中转培养，37℃振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为1mM，在30℃振荡诱导培养3‑8h，然后用超声波破碎细胞，并离心分离，收集上清部分；所述融合抗菌肽CAD‑Buforin II的纯化和裂解是将上述分离所得的上清液送入到NTA层析柱中，流速控制在0.3mlmin进行纯化，取经过NTA纯化的融合蛋白溶液，向其中加入盐酸羟胺至1‑4M，调pH值至7‑9.5，在35‑50℃下切割1‑12个小时，制得天蚕素AD和蛙Buforin II的复合溶液。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 用羟胺切割法制备天蚕素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途

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