申请/专利权人：广西壮族自治区农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所

申请日：2018-05-30

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN108680567B

主分类号：G01N21/76(20060101)

分类号：G01N21/76(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2018.11.13#实质审查的生效;2018.10.19#公开

摘要：本发明提供一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，涉及食品检测技术领域。该检测方法采用功能化核酸探针、纳米材料、工具酶信号放大、生物识别事件相结合的技术，利用λ核酸外切酶进行循环补助信号放大，稳定的G‑QuadruplexesHeminDNAzyme结构，表现出类似于过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化luminal产生化学发光并避免背景光和杂散光的干扰，并且鲁米诺产生的化学发光与WS2纳米材料在一定条件下发生化学发光共振能量转移，可大大提高检测灵敏度。

主权项：1.一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.首先将核酸适配体与磷酸化DNA在35-37℃下杂交1-2h，杂交完成后，加入λ核酸外切酶，在35-37℃下温育30-35min；所述核酸适配体为单链DNA探针，其碱基序列为5′-3′：GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAAT；所述磷酸化DNA的碱基序列为5′-3′：PO4---ATTTACCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC；S2.将步骤S1得到的溶液加热到75℃保持10-15min再冷却至35-37℃孵育1-1.5h；然后加入血红素和赭曲霉毒素A标准液，充分混和均匀后，在室温下孵育0.5-1h充分反应，得混合溶液；S3.将WS2纳米材料、鲁米诺、过氧化氢加入到所述混合溶液中，得到化学发光传感器体系；S4.在室温下立即测量化学发光传感器体系的化学发光强度，绘制标准曲线；S5.将赭曲霉毒素A待测液代替赭曲霉毒素A标准液，重复步骤S1、S2和S3制备化学发光传感器体系并测量其化学发光强度，达到对赭曲霉毒素A定量检测的目的。

全文数据：一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法技术领域[0001]本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法。背景技术[0002]由真菌毒素引起的食品安全是全球关注的问题。真菌毒素在全球范围内威胁食品和农产品的质量安全，食用经由其污染的食品和农产品容易引起真菌性食物中毒，严重危害人体健康甚至危及生命，其中尤以黄曲霉毒素和赭曲霉毒素毒性最大、污染最为严重。赭曲霉毒素（ochratoxin主要由赫曲霉Aspergillusochraceors、纯绿青霉Peniciliumviridicatum、疵孢青霉Peniciliumverruculosum等真菌产生的结构相似的次级代谢产物。它是异香豆素的一系列衍生物，包括A、B、C等结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素AochratoxinΑ，0ΤΑ毒性最大，可损害动物的肝脏和肾脏，有致癌、致畸和致突变的作用。[0003]传统检测赭曲霉毒素的方法主要是薄层色谱法、高效液相色谱法以及酶联免疫吸附法等，尽管传统方法已被广泛使用，但仍然在检测时间，灵敏度、设备成本或操作等方面存在缺陷。因此，研发简单、快速、灵敏检测赭曲霉毒素的新方法、新技术，具有重要研究价值和实际意义。生物传感器是一种集生物识别元素和信号转换元素为一体的分析检测装置，其可选择性的提供定性或定量的分析信号，从而实现对目标物的准确测定。目前，生物传感器主要采用光学、电化学、热学、声学等方式来获取检测信号。其中，光学传感器技术因具有分析成本低、分析时间短、操作简单，且可以进行原位甚至活体分析等优势，在临床诊断、生命过程研究、食品分析、药物分析、环境监测、以及生物芯片等领域具有十分广阔的应用前景。[0004]目前，光学传感领域的研究热点是以核酸为分子识别元素构建的生物传感器，由于其研究尚处初步阶段，在真菌毒素测定方面面临提高灵敏度等挑战。因此，迫切需要与其它方法和材料相结合，构建新型生物传感器，以满足真菌毒素的高选择、超灵敏检测。在专利CN103808701A中描述了一种基于赭曲霉毒素A的核酸适配体荧光嵌合染料检测赭曲霉毒素A的方法，利用赭曲霉毒素A的核酸适配体与互补序列形成一个检测元件，利用嵌合染料作为报告分子检测样本中的赭曲霉毒素A，加快了检测速度和提高了检测灵敏度，但是，化学发光信号的放大不明显，导致检测速度和灵敏度受到一定的影响。发明内容[0005]本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，充分利用纳米材料的生物相容性、尺寸效应、增敏或吸附作用，功能化核酸的高特异性以及工具酶的信号放大作用，有效的使信号放大，并避免背景光和杂散光的干扰，从而提高检测的灵敏度。[0006]为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：[0007]—种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，包括以下步骤：[0008]SI.首先将核酸适配体与磷酸化DNA在35-37°C下杂交l-2h，杂交完成后，加入λ核酸外切酶，在35-37°C下温育30-35min。[0009]S2.将步骤SI得到的溶液加热到75°C保持10-15min再冷却至35-37°C孵育l_1.5h;然后加入血红素hemin或者血红素和赭曲霉毒素A简称OTA标准液，充分混和均匀后，在室温下孵育0.5-lh充分反应，得混合溶液。该反应保证血红素或者血红素和赭曲霉毒素A与OTAaptamer_12merIinker-DNAzyme核酸适配体充分反应，形成稳定的OTAaptamer-12merlinker-G-QuadruplexesHeminDNAzyme结构或者G-QuadruplexesOTAaptamer-12merlinker-G-QuadruplexesHeminDNAzyme结构。[0010]S3.将二硫化钨WS2纳米材料、鲁米诺、过氧化氢加入到所述混合溶液中，得到化学发光传感器体系。[0011]S4.在室温下立即测量化学发光传感器体系的化学发光强度，绘制标准曲线。[0012]在无OTA存在时，OTAaptamer_12merlinker-G-QuadruplexesHeminDNAzyme吸附在WS2纳米材料的表面，促进鲁米诺和WS2纳米材料之间发生化学发光共振能量转移化学发光被猝灭），能检测到较弱的化学发光强度。在OTA存在下，G-QuadruplexesOTAaptamer_12merlinker-G-QuadrupIexesHeminDNAzyme结构远离WS2纳米材料表面，从而阻止鲁米诺和WS2纳米材料两者间的化学发光共振能量转移，同一条件下，化学发光得到恢复，能检测到较强的化学发光强度。且相对化学发光强度AIΔI=I—IQ，IQ为无OTA存在时鲁米诺的化学发光强度，I为不同浓度的OTA存在时鲁米诺的化学发光强度与OTA在一定浓度范围内成线性关系。[0013]S5.将赭曲霉毒素A待测液代替赭曲霉毒素A标准液，重复步骤SI、S2和S3制备制备化学发光传感器体系并测量其化学发光强度，达到对赭曲霉毒素A定量检测的目的。[0014]通过化学发光分析仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有赭曲霉毒素A，并根据标准曲线实现定量检测赭曲霉毒素A的目的。[0015]优选的，所述核酸适配体为单链DNA探针，其碱基序列为：GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAATo[0016]优选的，其特征在于，所述磷酸化DNA的碱基序列为:P〇4ATTTACCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC。[0017]优选的，所述WS2纳米材料粒径为2·5-3·5nm。[0018]优选的，所述测定方法的检测限为0.03ngmL。[0019]优选的，所述方法能够用于小麦、大米、玉米、花生及其制品中赭曲霉毒素A的检测。[0020]由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：[0021]1.本发明的一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，采用功能化核酸探针、纳米材料、工具酶信号放大、生物识别事件相结合的技术，充分利用纳米材料的生物相容性、尺寸效应、增敏或吸附作用，功能化核酸的高特异性以及工具酶的信号放大作用，有效的使信号放大，并避免背景光和杂散光的干扰，从而实现检测的快捷和高灵敏度。[0022]2.本发明的一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，利用λ核酸内切酶可作用于5磷酸化的双链DNA分子，并沿5—3方向逐渐进性催化去除5单核苷酸，破坏双链DNA的夹心结构）进行循环补助信号放大，稳定的G-QuadruplexesHeminDNAzyme结构，表现出类似于过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化luminal产生化学发光避免背景光和杂散光的干扰），并且luminal产生的化学发光与二硫化钨WS2纳米材料在一定条件下发生化学发光共振能量转移化学发光猝灭或者恢复），可大大提高检测灵敏度。通过工具酶信号放大、核酸探针、纳米材料的灵活组合，采用化学发光光学手段，实现检测信号增强，实现真菌毒素的超灵敏检测。附图说明[0023]图1为基于功能化核酸的化学发光传感器检测赭曲霉毒素A的原理图。[0024]图2为基于功能化核酸的化学发光传感器检测赭曲霉毒素A的标准曲线。具体实施方式[0025]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0026]—、相关试剂材料[0027]所有DNA片段均由上海生工生物有限公司提供，DNA序列使用前未经过任何纯化具体碱基序列如表1所示）。鲁米诺（Iuminol、过氧化氢H2O2购于国药上海试剂公司；赭曲霉毒素六1^、血红素116111；[11、1'|-2-轻乙基昵嗪-1'1’-2-乙磺酸]1奶^购于美国8丨81]^公司；λ核酸外切酶LambdaexonucleaseAexo购于美国NewEnglandBiolabs公司；二硫化妈WS2纳米材料购于南京先丰纳米材料科技有限公司。[0028]表IDNA序列[0030]实施例1[0031]—种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，包括以下步骤：[0032]SI.首先将OTAaptamer_12merlinker-DNAzyme核酸适配体与磷酸化DNA在35°C下杂交2h，杂交完成后，加入λ核酸外切酶，在35°C下温育35min。[0033]所述OTAaptamer_12merlinker-DNAzyme核酸适配体碱基序列为：GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAATo[0034]所述磷酸化DNA的碱基序列为：P〇4---ATTTACCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC〇[0035]S2.将步骤S1得到的溶液加热到75°C保持15min再冷却至35°C孵育1.5h;然后加入血红素和赭曲霉毒素A标准液，充分混和均匀后，在室温下孵育Ih充分反应，得混合溶液。[0036]S3.将WS2纳米材料、鲁米诺、过氧化氢加入到所述混合溶液中，得到化学发光传感器体系。所述WS2纳米材料粒径为2.5nm。[0037]S4.在室温下立即测量化学发光传感器体系的化学发光强度，绘制标准曲线。[0038]S5.将赭曲霉毒素A待测液代替赭曲霉毒素A标准液，制备化学发光传感器体系并测量其化学发光强度，达到对赭曲霉毒素A定量检测的目的。[0039]实施例2[0040]—种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，包括以下步骤：[0041]SI·首先将OTAaptamer_12merlinker-DNAzyme核酸适配体与磷酸化DNA在37°C下杂交Ih，杂交完成后，加入λ核酸外切酶，在37°C下温育30min。[0042]所述OTAaptamer-12merlinker-DNAzyme核酸适配体碱基序列为：GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAATo[0043]所述磷酸化DNA的碱基序列为：P〇4---ATTTACCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC。[0044]S2.将步骤Sl得到的溶液加热到75°C保持IOmin再冷却至37°C孵育Ih;然后加入血红素和赭曲霉毒素A标准液，充分混和均匀后，在室温下孵育0.5h充分反应，得混合溶液。[0045]S3.将WS2纳米材料、鲁米诺、过氧化氢加入到所述混合溶液中，得到化学发光传感器体系。所述WS2纳米材料粒径为3.5nm[0046]S4.在室温下立即测量化学发光传感器体系的化学发光强度，绘制标准曲线。[0047]S5.将赭曲霉毒素A待测液代替赭曲霉毒素A标准液，制备化学发光传感器体系并测量其化学发光强度，达到对赭曲霉毒素A定量检测的目的。[0048]实施例3[0049]—种基于功能化核酸的化学发光传感器检测大米中赭曲霉毒素A的测定方法，包括以下步骤：[0050]一、.待测样品的制备[0051]取25g大米样品，粉碎、混匀备用。[0052]二、赭曲霉毒素A的提取[0053]称取5g已粉碎混匀的大米粉，加入20mL磷酸盐缓冲液PBS，pH7.0,0.01molL，内含50%甲醇），涡旋提取IOmin后，超声处理20min;离心，取上清液作为待测液，供检测。[0054]三、标准曲线绘制[0055]SI·首先将OTAaptamer_12merlinker-DNAzyme核酸适配体与磷酸化DNA在36°C下杂交Ih，杂交完成后，加入λ核酸外切酶，在36°C下温育30min。[0056]所述OTAaptamer_12merlinker-DNAzyme核酸适配体碱基序列为：GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAATo[0057]所述磷酸化DNA的碱基序列为：P〇4---ATTTACCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC〇[0058]S2.将步骤SI得到的溶液加热到75°C保持12min再冷却至37°C孵育80min;然后加入血红素和赭曲霉毒素A标准液，充分混和均匀后，在室温下孵育40min充分反应，得混合溶液。[0059]所述赭曲霉毒素A标准液的浓度依次为：0ngmL、0.001ngmL、0.01ngmL、0.IngmL、IngmL、2ngmL、20ngmL、200ngmL〇[0060]S3.将WS2纳米材料、鲁米诺、过氧化氢加入到所述混合溶液中，得到化学发光传感器体系。所述WS2纳米材料粒径为3nm。[0061]S4.在室温下立即测量化学发光传感器体系的化学发光强度，绘制标准曲线。[0062]相对化学发光强度ΔIΔI=I—1〇,1〇为无OTA存在时luminal的化学发光强度，I为不同浓度的OTA存在时luminal的化学发光强度与赭曲霉毒素A的浓度C在0.1〜200ngmL范围内成线性关系，Λ1=2.03+0.346C，R2=0.998。[0063]检测限（3〇,〇=S〇S，S为空白溶液多次测量的标准偏差;S为标准曲线的斜率为0.03ngmL〇[0064]四、赭曲霉毒素A的检测[0065]将待测液代替赭曲霉毒素A标准液，重复步骤S1、S2和S3制备化学发光传感器体系并测量其化学发光强度，对照标准曲线，得到赭曲霉毒素A的含量为0.13ugkg，达到精确定量分析的目的。[0066]上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围。凡本发明所提示的技术构思下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

权利要求：1.一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：51.首先将核酸适配体与磷酸化DNA在35-37°C下杂交l_2h，杂交完成后，加入λ核酸外切酶，在35-37°C下温育30-35min;52.将步骤SI得到的溶液加热到75°C保持10_15min再冷却至35-37°C孵育l_1.5h;然后加入血红素和赭曲霉毒素A标准液，充分混和均匀后，在室温下孵育0.5-lh充分反应，得混合溶液；53.将WS2纳米材料、鲁米诺、过氧化氢加入到所述混合溶液中，得到化学发光传感器体系；54.在室温下立即测量化学发光传感器体系的化学发光强度，绘制标准曲线；55.将赭曲霉毒素A待测液代替赭曲霉毒素A标准液，重复步骤SI、S2和S3制备化学发光传感器体系并测量其化学发光强度，达到对赭曲霉毒素A定量检测的目的。2.根据权利要求1所述的基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，其特征在于，所述核酸适配体为单链DNA探针，其碱基序列为（5-3Ο:GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAATo3.根据权利要求1所述的基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，其特征在于，所述磷酸化DNA的碱基序列为（5-30:P〇4ATTTACCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC。4.根据权利要求1-3任一所述的基于功能化核酸的化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述WS2纳米材料粒径为2.5-3.5nm。5.根据权利要求1-3任一所述的基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，其特征在于，所述测定方法的检测限为〇.〇3ngmL。6.根据权利要求1-3任一所述的基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素A的测定方法，其特征在于，所述方法能够用于小麦、大米、玉米、花生及其制品中赭曲霉毒素A的检测。

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