申请/专利权人：长沙艾迪康医学检验实验室有限公司

申请日：2017-04-05

公开（公告）日：2020-11-06

公开（公告）号：CN106868184B

主分类号：C12Q1/6858(20180101)

分类号：C12Q1/6858(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.06#授权;2017.07.14#实质审查的生效;2017.06.20#公开

摘要：本发明公开了一种检测常染色体隐性遗传病丙酮酸激酶缺乏症患者PKLR基因突变的引物和方法，其包括i扩增PKLR基因全外显子序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将丙酮酸激酶缺乏症患者体内PKLR基因全外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断丙酮酸激酶缺乏症，对早期干预、早期治疗和产前诊断有重要的参考意义。

主权项：1.一种检测PKLR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液和测序体系反应液，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液包括多对扩增引物，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，所述多对扩增引物为PKLR-1FPKLR-1R、PKLR-2FPKLR-2R、PKLR-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-10R和PKLR-11FPKLR-11R，其碱基序列为：PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；PKLR-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；PKLR-10R：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；PKLR-11F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA；M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。

全文数据：检测PKLR基因突变的方法、试剂盒、寡核苷酸及其应用背景技术[0001]红细胞丙酮酸激酶是糖酵解途径的三个关键限速酶之一。其作用为催化磷酸烯酮式丙酮酸转化为丙酮酸，同时产生ATP为红细胞提供能量。丙酮酸激酶pyruvatekinase,PK有四种同工酶4、1?^2，其中1?型存在于成熟的红细胞中，由？11^基因编码。红细胞中的丙酮酸激酶遗传性缺乏可引起红细胞能量代谢异常，非球性细胞性溶血性贫血，其分子水平上则存在PKLR基因的突变。[0002]PKLR基因位于1号染色体长臂2区1带，包含11个外显子，共编码574个氨基酸。PKLR基因突变是丙酮酸激酶缺乏症的重要原因。自1961年初次报道后，迄今为止国内外共发现200余例PKLR突变。PKLR的突变种类几乎遍布整个基因，其中最常见的突变为错义突变，包括美国和欧洲的热点突变1529GA，南欧的热点突变1456CT和亚洲的1468CT。[0003]到目前为止PKLR基因的突变是如何引起酶缺乏的机制尚未完全清楚，其可能原因有:部分突变位于丙酮酸激酶活性中心，改变了底物磷酸烯醇式丙酮酸的结合力;部分突变可能引起突变点附近的疏水性下降，影响K+与其结合，导致Km升高；少数位于C区的突变会使结构改变，减弱亚单位间连接，影响三聚体形成，从而降低丙酮酸激酶的活性。[0004]丙酮酸激酶缺乏症的患者严重时在新生儿期即出现严重贫血、需要终生输血。目前临床以检测丙酮酸激酶活性的方法来诊断丙酮酸激酶缺乏症，但这受到多种因素的影响，所以无论对是患者还是对产前诊断来说，对PKLR基因进行全外显子测序都具有非常重要的意义。发明内容[0005]本发明的目的在于提供检测PKLR基因突变的寡核苷酸，采用PCR技术，可用于快速检测丙酮酸激酶缺乏症患者体内的PKLR基因外显子突变情况。所述寡核苷酸包括至少一对扩增PKLR基因外显子的引物，所述至少一对扩增引物选自PKLR-1FPKLR-1R、PKLR-2FPKLR-2R、PKLR-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-10R，或PKLR-11FPKLR-11R，其碱基序列为：[0006]PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；[0007]PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；[0008]PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；[0009]PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；[0010]PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；[0011]PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；[0012]PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；[0013]PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；[0014]PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；[0015]PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；[0016]PKLR-1OF：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；[0017]PKLR-1OR：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；[0018]PKLR-1IF：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；[0019]PKLR-11R:AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA〇[0020]进一步地，所述寡核苷酸还包括一对测序引物Ml3F和Ml3R，其碱基序列为：[0021]Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT；[0022]M13R:AACAGCTATGACCATG。[0023]进一步地，PKLR-1F:PKLR-1R、PKLR-2F:PKLR-2R、PKLR-3-4-5F:PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F:PKLR-6-7R、PKLR-8-9F:PKLR-8-9R、PKLR-1OF:PKLR-1OR，或PKLR-1IF:PKLR-11R的比值均为1。[0024]进一步地，M13F:M13R的比值为1。[0025]进一步地，所述寡核苷酸在辅助检测丙酮酸激酶缺乏症中的应用。[0026]本发明的目的还在于提供一种检测PKLR基因突变的方法，包括以下步骤：[0027]1抽提样本中的基因组DNA;[0028]2利用至少一对扩增引物对⑴中的DNA进行扩增，获得扩增产物；[0029]⑶利用一对测序引物M13F和M13R对⑵中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的喊基序列；[0030]⑷将⑶中的碱基序列与PKLR基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其中，所述至少一对扩增引物选自卩1〇^-1卩?10^-11?、？10^-2卩?10^-21?、？10^-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-10R，或PKLR-11FPKLR-11R，其碱基序列为：[0031]PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；[0032]PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；[0033]PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；[0034]PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；[0035]PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；[0036]PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；[0037]PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；[0038]PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；[0039]PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；[0040]PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；[0041]PKLR-1OF：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；[0042]PKLR-1OR：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；[0043]PKLR-1IF：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；[0044]PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA；[0045]Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT；[0046]M13R:AACAGCTATGACCATG。[0047]进一步地，PKLR-1F:PKLR-1R、PKLR-2F:PKLR-2R、PKLR-3-4-5F:PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F:PKLR-6-7R、PKLR-8-9F:PKLR-8-9R、PKLR-1OF:PKLR-1OR，或PKLR-1IF:PKLR-11R的比值均为1。[0048]进一步地，M13F:M13R的比值为1。[0049]进一步地，所述方法在辅助检测丙酮酸激酶缺乏症中的应用。[0050]本发明的目的还在于提供一种检测PKLR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其中，检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F和Ml3R，所述至少一对扩增引物选自？11^-lFPKLR-lR、PKLR-2FPKLR-2R、PKLR-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-1OR，或PKLR-11FPKLR-11R，其碱基序列为：[0051]PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；[0052]PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；[0053]PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；[0054]PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；[0055]PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；[0056]PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；[0057]PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；[0058]PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；[0059]PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；[0060]PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；[0061]PKLR-1OF：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；[0062]PKLR-1OR：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；[0063]PKLR-1IF：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；[0064]PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA；[0065]Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT；[0066]M13R:AACAGCTATGACCATG。[0067]进一步地，PKLR-1F:PKLR-1R、PKLR-2F:PKLR-2R、PKLR-3-4-5F:PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F:PKLR-6-7R、PKLR-8-9F:PKLR-8-9R、PKLR-1OF:PKLR-1OR，或PKLR-1IF:PKLR-11R的比值均为1。[0068]进一步地，M13F:M13R的比值为1。[0069]进一步地，所述检测体系？0財广增反应液还包括2\?0?8虹€61、1町？8和100?父DNAPolymerase〇[0070]进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、牛小肠碱性磷酸酶、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和BigdyeTerminatorV3.1〇[0071]进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶I、牛小肠碱性磷酸酶。[0072]进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。[0073]进一步地，所述试剂盒在辅助检测丙酮酸激酶缺乏症中的应用。[0074]进一步地，引物序列PKLR-1F和PKLR-1R是扩增PKLR基因第1号外显子序列的引物，引物序列PKLR-2F和PKLR-2R是扩增PKLR基因第2号外显子序列的引物，引物序列PKLR-3-4-5F和PKLR-3-4-5R是扩增PKLR基因第3、4和5号外显子序列的引物，引物序列PKLR-6-7F和PKLR-6-7R是扩增PKLR基因第6、7号外显子序列的引物，引物序列PKLR-8-9F和PKLR-8-9R是扩增PKLR基因第8、9号外显子序列的引物，引物序列PKLR-10F和PKLR-10R是扩增PKLR基因第10号外显子序列的引物，引物序列PKLR-1IF和PKLR-11R是扩增PKLR基因第11号外显子序列的引物。[0075]有益效果：（1本发明设计了扩增PKLR基因全部11个外显子序列的引物，通过加接头，使所有7对引物的PCR产物均可以用一对测序引物进行测序，而现有的测序技术要对每种扩增产物设计特异性的测序引物，这就需要设计7条测序引物单向测序或14条测序引物双向测序），因此，本发明所述引物既能将所述PKLR全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况；（2在设计引物时，通过让PKLR基因的第3、4和5号外显子共用一对引物，让PKLR基因的第6和7号外显子共用一对引物，让PKLR基因的第8和9号外显子共用一对引物，显著降低扩增引物的数量，这也会降低扩增产物的数量，从而降低测序引物的数量，因而极大地降低检测成本；（3本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳；（4常用的荧光定量PCR法要针对PKLR基因全部11个外显子可能发生突变的众多突变位点设计多个探针，因此，在11个外显子中，假设每个外显子存在3个突变位点，则要设计33个探针，检测成本显著增加，而本发明通过给设计的扩增引物添加接头，仅需使用一对测序引物就可检测这33个突变位点以及还未被发现的其他突变类型，从而使得检测成本显著降低。附图说明[0076]图1为PKLR基因在染色体上的定位图。[0077]图2为PKLR-lFPKLR-lR、PKLR-2FPKLR-2R、PKLR-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-1OR、PKLR-11FPKLR-11R的电泳图。[0078]图3、4、5、6、7、8、9分别为样本1的PKLR基因第1、2、345、67、89、10、11号外显子野生型测序截图。具体实施方式[0079]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。[0080]实施例1[0081]一种检测PKLR基因多态突变位点的寡核苷酸，该寡核苷酸是针对PKLR基因至少一个外显子所设计的，包括至少一对扩增引物，所述至少一对扩增引物选自？10^-1??10^-lR、PKLR-2FPKLR-2R、PKLR-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-1OR，或PKLR-11FPKLR-11R，其碱基序列为：[0082]PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；[0083]PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；[0084]PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；[0085]PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；[0086]PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；[0087]PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；[0088]PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；[0089]PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；[0090]PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；[0091]PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；[0092]PKLR-1OF：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；[0093]PKLR-1OR：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；[0094]PKLR-1IF：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；[0095]PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA〇[0096]所述寡核苷酸还包括一对测序引物Ml3F和Ml3R，其碱基序列为：[0097]Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT；[0098]M13R:AACAGCTATGACCATG。[0099]—种检测PKLR基因突变的试剂盒，包括检测体系PCR扩增反应液和测序体系反应液，其中，[0100]检测体系PCR扩增反应液包括:2XPCRBufferlO.OyL;dNTPs2mM;K0DFXDNAPolymeraselUyl;PKLR基因11个外显子的上、下游引物PKLR-lFlOyM、PKLR-lR10yM、PKLR-2F10yM、PKLR-2R10yM、PKLR-3-4-5F10yM、PKLR-3-4-5R10yM、PKLR-6-7F10yM、PKLR-6-7R10yM、PKLR-8-9F10yM、PKLR-8-9R10yM、PKLR-10F10yM、PKLR-10R10yM、PKLR-llF10yM、PKLR-llR10yM。[0101]测序体系反应液包括：测序纯化液（核酸外切酶I:0.6U，牛小肠碱性磷酸酶：1.2U;EDTA125mM;无水乙醇；75%乙醇；HIDI高度去离子甲酰胺）；一对测序引物M13F3.2tiM、M13R3.2iiM;BigdyeTerminatorV3.1贝勾买自美国AppliedBiosystems公司）。[0102]优选地，该试剂盒还包括血液DNA抽提试剂。[0103]优选地，该试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。阳性对照品为含有人PKLR基因外显子DNA的溶液，严禁反复冻融。阴性对照品为ddH20。空白对照品为2iU生理盐水或不加任何物质。[0104]实施例2血液样本DNA抽提[0105]血液样本DNA抽提根据天根生物血液细胞组织基因DNA提取试剂盒说明书）：抽提人血液样本DNA，具体抽提方法如下：[0106]1抽取300yl血液加入900yl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心lmin，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200iU缓冲液GA，振荡至彻底混勾；[0107]⑵加入20y1蛋白酶K溶液，混匀；[0108]3加入200yl缓冲液GB，充分颠倒混勾，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；[0109]⑷加入200iil无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；[0110]5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；[0111]6向吸附柱CB3中加入500yl缓冲液GD使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；[0112]7向吸附柱CB3中加入700yl漂洗液PW使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；[0113]⑶向吸附柱CB3中加入500yl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液；[0114]⑶将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；[0115]10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100yl洗脱缓冲液TE，室温放置2〜5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。[0116]实施例3样本DNA扩增[0117]按照实施例2抽提的血液样本DNA，然后利用实施例1中的扩增引物扩增人PKLR基因外显子，获得扩增产物。扩增时在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABIveriti美国AppliedBiosystems公司）等。详情如下所示：[0118]⑴按样品数n样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个+空白对照1个）取测体系PCR扩增反应液，每管19yL分装于反应管中；[0119]ii将上述处理好的待测样本和阴性对照品、阳性对照品各取lyL分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，获得扩增产物。测体系PCR扩增反应液配制方法如表1所示。PCR扩增扩增反应条件如表2所示。每对扩增引物的详细信息如表3所示。[0120]表1.测体系PCR扩增反应液配制[0121][0122]注：表中的PrimerF和PrimerR选自卩10^-1卩?10^-11?、？11^-2卩?10^-21?、？10^-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-10R，或PKLR-11FPKLR-11R。[0123]表2.PCR扩增反应条件[0124][0125]表3.每对扩增引物信息[0126][0128]实施例4Sanger测序[0129]取9yl实施例3中的扩增产物和2yl实施例1中的测序纯化液按照表4中所述的程序进行纯化，从而获得纯化产物。[0130]表4纯化程序[0131][0132]将lyl所获得的纯化产物分别与实施例1中的测序引物M13F3.2yM、M13R3.2yM按照表5中的体系进行混合，然后按照表6中的测序反应程序进行测序。[0133]表5[0134][0135]表6.测序反应程序[0136][0137]沉淀环节：[0138]向完成测序反应的产物中加入2yl125mM的EDTA，静置5min;加入151无水乙醇，漩祸混勾；3700rpm离心30min;倒置离心15sec，加入50170%乙醇，漩祸混勾；3700rpm离心15min;倒置离心15sec，置于95°C金属浴上;加入10ylHIDI后进行变性试验。变性试验步骤为:95°C，5min;接着在-30°C2min，然后在4°C保存。[0139]变性程序结束后，上测序仪ABI3730测序。[0140]结果判断：[0141]分别将测序结果与PKLR野生型参考序列（Genbankaccn:NC_000001.11进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。[0142]实施例5临床样本检测[0143]取3例临床血液样本样本编号为1〜3先后按照实施例1、实施例2、实施例3和实施例4,配制试剂、抽提样本DNA、扩增获得扩增产物和测序。每份样本往检测体系PCR反应液中加入lyl。[0144]利用所获得的扩增产物，开展DNA电泳，电泳条件为1.5%琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。电泳结果如图2所示。[0145]图2为这3例血液样本以卩11^-1卩?11^-11?、？11^-2卩?11^-21?、？11^-3-4-5卩?11^-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-10FPKLR-10I^PPKLR-llFPKLR-11R等7对扩增引物扩增后所得扩增产物的电泳图谱，M为MarkerDL2000,1〜3为送检的血液样本编号1〜3号。这6对引物扩增的片段长度分别为335bp、322bp、838bp、766bp、662bp、373bp、644bp，通过电泳图的分析表明这7对引物扩增有效，且条带单一。[0146]在这3例样品中，以样本1为例进行详细说明。样本1的测序结果如图3-9所示。[0147]图3显示是样本1的PKLR基因第1号外显子野生型测序截图，说明样本1的1号外显子未发生突变。[0148]图4显示是样本1的PKLR基因第2号外显子野生型测序截图，说明样本1的2号外显子未发生突变。[0149]图5显示是样本1的PKLR基因第3、4、5号外显子野生型测序截图，说明样本1的3、4、5号外显子未发生突变。[0150]图6显示是样本1的PKLR基因第6、7号外显子野生型测序截图，说明样本1的6、7号外显子未发生突变。[0151]图7显示是样本1的PKLR基因第8、9号外显子野生型测序截图，说明样本1的8、9号外显子未发生突变。[0152]图8显示是样本1的PKLR基因第10号外显子野生型测序截图，说明样本1的10号外显子未发生突变。[0153]图9显示是样本1的PKLR基因第11号外显子野生型测序截图，说明样本1的11号外显子未发生突变。[0154]从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把PKLR基因共11个外显子序列包括在内了，能够扩展出PKLR基因全部11个外显子，并且测序结果完全准确。由检测结果可知，样本1的11个外显子均为野生型。另外，对PKLR基因外显子突变阳性样本的检测也表明本发明的寡核苷酸、方法和试剂盒能够检测出PKLR基因外显子突变的突变情况。

权利要求：1.一种检测PKLR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，所述至少一对扩增引物选自PKLR-1FPKLR-1R、PKLR-2FPKLR-2R、PKLR-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-IOFPKLR-1OR，或PKLR-11FPKLR-1IR，其碱基序列为：PKLR-IF：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；PKLR-IR：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；PKLR-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；PKLR-IOR：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；PKLR-IIF：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；PKLR-IIR：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA；Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R:AACAGCTATGACCATG。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2XPCRBuffer、dNTPs和KODFXDNAPolymerase。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、牛小肠喊性磷酸酶、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和BigdyeTerminatorV3·1。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述测序纯化液包括核酸外切酶I、牛小肠碱性磷酸酶。5.检测PKLR基因突变的寡核苷酸，其特征在于，包括:至少一对扩增PKLR基因外显子的引物，所述至少一对扩增引物选自PKLR-1FPKLR-1RJKLRIFA3KLRjI^PKLRmFPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-1OFPKLR-1OR，或PKLR-11FPKLR-11R，其碱基序列为：PKLR-IF：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；PKLR-IR：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；PKLR-IOF：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；PKLR-IOR：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；PKLR-IIF：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA〇6.如权利要求5所述的寡核苷酸，其特征在于，还包括一对测序引物，其碱基序列为：Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R:AACAGCTATGACCATG。7·如权利要求5所述的寡核苷酸，其特征在于，PKLR-IF:PKLR-1R、PKLR-2F:PKLR-2R、PKLR-3-4-5F:PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F:PKLR-6-7R、PKLR-8-9F:PKLR-8-9R、PKLR-10F:PKLR-10R，或PKLR-IIF:PKLR-IIR的比值均为1。8.如权利要求7所述的寡核苷酸，其特征在于，M13F:M13R的比值为1。9.如权利要求5〜8之一所述的寡核苷酸在辅助检测丙酮酸激酶缺乏症中的应用。10.—种检测PKLR基因突变的方法，包括以下步骤：1抽提样本中的基因组DNA;⑵利用至少一对扩增引物对⑴中的DNA进行扩增，获得扩增产物；⑶利用一对测序引物M13F和M13R对⑵中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的喊基序列；4将（3中的碱基序列与PKLR基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，所述至少一对扩增引物选自？1〇^-1??11^-11?、？10^-2??11^-21?、？11^-3-4-5FPKLR-3-4-5R、PKLR-6-7FPKLR-6-7R、PKLR-8-9FPKLR-8-9R、PKLR-IOFPKLR-1OR，或PKLR-11FPKLR-1IR，其碱基序列为：PKLR-IF：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；PKLR-IR：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；PKLR-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；PKLR-IOR：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；PKLR-IIF：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；PKLR-IIR：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA；Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R:AACAGCTATGACCATG。

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