申请/专利权人：浙江大学

申请日：2018-10-11

公开（公告）日：2021-02-05

公开（公告）号：CN109295064B

主分类号：C12N15/12(20060101)

分类号：C12N15/12(20060101);C07K14/435(20060101);C12N15/113(20100101);A01N37/46(20060101);A01P7/04(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.09.20#未缴年费专利权终止;2019.03.01#实质审查的生效;2019.02.01#公开

摘要：本发明公开了飞虱致死基因片段及其应用。本发明筛选出经干扰后能够导致飞虱死亡的序列如SEQIDNO.1所示的灰飞虱致死基因片段beta‑tubulin，利用该基因片段的dsRNA饲喂灰飞虱、褐飞虱，可有效地致死灰飞虱、褐飞虱，本发明对环境生态和食品都安全，为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。

主权项：1.灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA，其特征在于,序列如SEQIDNO.4所示。

全文数据：飞虱致死基因片段及其应用技术领域本发明属于农业生物技术领域，涉及飞虱致死基因片段及其应用。背景技术在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致灰飞虱对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外灰飞虱传播条纹病毒引起的水稻条纹叶枯病，发病后药剂控制效果较差，只能依靠治虫防病。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。RNA干扰RNAinterference，RNAi是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工大小约为22nt的小RNAsiRNA,通过序列配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于真菌、植物和动物中。2006年AndreFire和CraigMello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。我们团队致力于昆虫的RNA干扰研究，先前的研究实现对Ribosomal+protein+L9-B、Tubulin、Chitinase、Chitinase+7、ADP-ribosylation+factor、Alpha1-tubulin等基因的有效干扰，并将其应用于害虫防治。本专利发明从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致飞虱死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。发明内容本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供飞虱致死基因片段及其应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现：灰飞虱致死基因片段beta-tubulin，序列如SEQIDNO.1所示。所述的灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的克隆方法，包括如下步骤：1取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；2以步骤1合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQIDNO.2的上游引物P1、序列为SEQIDNO.3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；3PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；4将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌T1，涂于含有X-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养，过夜；5通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；6用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；7全自动序列仪进行测序，得到SEQIDNO.1所示的beta-tubulin基因片段。其中，所述的RT-PCR扩增体系为：反应缓冲液5μL，Mg2+4μL，dNTP4μL，cDNA模板2μL，上游引物P11μL，下游引物P21μL，R-Tag酶0.5μL，ddH2O32.5μL，共50μL；所述的反应程序为：94℃变性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸。灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA，序列如SEQIDNO.4所示。所述的灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA的合成方法，是以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQIDNO.5的上游引物P3、序列为SEQIDNO.6的下游引物P4，PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA。所述的灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA的合成方法优选包含如下步骤：1根据已经验证的beta-tubulin基因片段序列，设计并合成序列为SEQIDNO.5的上游引物P3和序列为SEQIDNO.6的下游引物P4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA，PCR体系为：反应缓冲液5μL，Mg2+4μL，dNTP4μL，cDNA模板2μL；上游引物P32μL，下游引物P42μL，ExTap酶0.25μL，ddH2O30.75μL，共50μL；PCR条件为：94℃变性2min，94℃30sec，55-62℃30sec，72℃30sec，38个循环，72℃延伸。2PCR产物经浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离；3回收目标产物。一种杀灭飞虱的方法，其特征在于，将灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA与饲料混合后饲喂飞虱；优选地，所述的飞虱为灰飞虱或褐飞虱；优选地，所述dsRNA的浓度为4000-6000ngμl；更加优选地，所述dsRNA的浓度为4500-5500ngμl。一种飞虱的dsRNA饲喂方法，包含如下步骤：1将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取二龄的飞虱加入玻璃管内，用纱布将玻璃管另一端封好；2将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜，贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；3用移液枪吸取含dsRNA的饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；4将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26℃，利用飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料；优选地，所述的飞虱为灰飞虱或褐飞虱；优选地，所述的dsRNA优选本发明的灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA。有益效果：1、利用RNAi技术沉默beta-tubulin基因，对灰飞虱、褐飞虱具有明显的致死效果，说明该基因可作为利用RNA干扰技术控制害虫的有效靶点。2、本发明合成的beta-tubulin基因dsRNA能有效沉默beta-tubulin基因，更好地抵抗RNA酶的降解，同时合成成本低，便于大规模应用。3、本发明beta-tubulin基因的RNAi对灰飞虱、褐飞虱具有显著的致死效果，为建立利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。具体实施方式实施例11.beta-tubulin基因片段的克隆方法：1取灰飞虱10-20头，用TRIzol法提取总RNA；2合成cDNA第一条链；3从灰飞虱转录组中获取基因片段序列，在http:www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性比对之后，预测为灰飞虱beta-tubulin基因，利用Primerpremier5.0软件设计P1和P2，以RT-PCR方法进行扩增；上游引物P1:5'AAATTGTAAGTGAAATCTG3'SEQIDNO.2，下游引物P2:5'GGCAAGAAGGAGAATTTA3'SEQIDNO.3；PCR条件为：94℃变性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸PCR反应体系50μL：4PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；5将回收的目标片段在T3连接酶作用下插入至pEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌T1，涂于含X-gal0.02gml、IPTG0.2gml以及氨苄青霉素50ngml的LB培养基，37℃培养，过夜；6通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；7用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；8全自动序列仪进行测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，即可得到SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的beta-tubulin基因片段。实施例2.dsRNA合成及回收1根据已经验证的beta-tubulin基因片段序列，采用PrimerPremier5.0软件设计P3和P4；上游引物P3:5'TAATACGACTCACTATAGGGTTGACCAGTCGGGAGTGT3'SEQIDNO.5下游引物P4:5'TAATACGACTCACTATAGGGGGTGATGGCATAACAGAA3'SEQIDNO.6PCR条件：94℃变性2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，38个循环，72℃延伸。2PCR产物经浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并在紫外灯下进行观察，其序列见SEQIDNO.4。3采用Promega公司的SVGelandPCRClean-UpSystem试剂盒进行回收：①对分离得到的目标片段切胶，并放入称量过重量a的1.5ml微量离心管中，再次称量b，b-a算得所切胶重；②根据胶重，每10mg凝胶加入10μLMembraneBindingSolution。凝胶重量不超过350mg；③将凝胶放入50–65℃水浴锅中水浴10min或者直到凝胶完全融化；④将试剂盒中的滤管放置在配套的收集管中，转移融化的凝胶液体至滤管中，室温放置1min；⑤16,000×g14,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；⑥加入700μlMembraneWashSolution已加入95％酒精，16,000×g14,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；⑦加入500μlMembraneWashSolution已加入95％酒精，16,000×g14,000rpm离心5min，弃去收集管中的液体；⑧不加液体空转1min；⑨转移滤管到1.5ml微量离心管中，加入50μlNuclease-FreeWater，室温放置1min，16,000×g14,000rpm离心1min；⑩收集到的目标产物保存在4℃或–20℃。实施例3飞虱饲喂dsRNA实验1将玻璃管的一端用封口膜封好，用吸虫器分别吸取二龄的飞虱灰飞虱、褐飞虱加入不同的玻璃管内，用纱布将另一端封好；2将虫子轻轻用手拍打至一端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜贴纸的一面朝上，均匀用力向两侧拉，拉成正方形，然后盖到玻璃管管口上，将管竖立放置在超净台面上；3用移液枪吸取饲料100μl滴在封口膜的中央，对照只加饲料配方见表2，处理组在饲料中加入beta-tubulin基因的dsRNA，dsRNA浓度为5200ngμl，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；4将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26℃，利用飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次饲料和dsRNA；5连续喂食五天，每24h统计一次死亡率，结果见表1。由表1可见饲喂beta-tubulin的dsRNA对灰飞虱、褐飞虱都具有显著的致死效果。表1表2应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表110浙江大学120飞虱致死基因片段及其应用1606170SIPOSequenceListing1.021072111815212DNA213灰飞虱Laodelphaxstriatellus4007aaattgtaagtgaaatctgaaaatatgagagaaatagtgcatcttcaagccggacaatgc60ggaaatcaaataggagcgaggttctggcaagtaatatcagaggagcatggcattgaccag120tcgggagtgtatcaaggaacgtctgatcttcaacttgaaagaataagcgtctactataat180gaagcatgtgcgagccgcggaggtggcagcggcaagtacgtgcctcggtcgattctgctc240gatttggagccgggcacaatggacgcggtgcgctccggtccctacggccagctgtttcgg300ccggacaactttgtgttcggccaaagcggcgccggcaacaactgggccaagggacattac360accgagggcgccgagctcgtcgacgtcgtgctcgacgtggtcagaaaggagtgcgagaat420tgcgactgcttgcagggattccaactgacccattcactaggaggaggaactggtcagggt480tgggaacacttttgatctctaaa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权利要求：1.灰飞虱致死基因片段beta-tubulin，其特征在于，序列如SEQIDNO.1所示。2.一种扩增权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的引物，其特征在于，包含以序列为SEQIDNO.2的上游引物P1、序列为SEQIDNO.3的下游引物P2。3.权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA，其特征在于,序列如SEQIDNO.4所示。4.权利要求3所述的灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA的合成方法，其特征在于：以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQIDNO.5的上游引物P3、序列为SEQIDNO.6的下游引物P4，PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段beta-tubulin的dsRNA。5.一种杀灭飞虱的方法，其特征在于，将权利要求3所述的dsRNA与饲料混合后饲喂飞虱。6.根据权利要求3所述的杀灭飞虱的方法，其特征在于，所述的飞虱为灰飞虱或褐飞虱。7.根据权利要求5所述的杀灭飞虱的方法，其特征在于，所述dsRNA的浓度为4000-6000ngμl。

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