申请/专利权人：斯格普斯生命科学公司

申请日：2017-06-15

公开（公告）日：2023-02-28

公开（公告）号：CN109715659B

主分类号：C07K16/18

分类号：C07K16/18;G01N33/68

优先权：["20160616 SE 1650855-8"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.02.28#授权;2019.05.28#实质审查的生效;2019.05.03#公开

摘要：提供了包含氨基酸序列N‑末端‑SGPTH的肽和针对该肽的抗体。该肽可用于人和动物，特别是马的诊断。特别地，该抗体可用于诊断如骨关节炎或动脉粥样硬化的全身性低级别慢性炎性疾病，或神经变性疾病或神经炎性疾病。

主权项：1.抗体在制备用于诊断的试剂盒中的用途，所述诊断为受试对象的骨关节炎的诊断，所述抗体特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽，其中，所述抗体结合序列N-末端SGPTH，所述抗体不与具有序列PPGYSGPTHEGVGMC的未切割的肽结合，N-末端-SGPTH的肽的N-末端是所述抗体的表位的一部分；所述骨关节炎是早期骨关节炎。

全文数据：用于诊断骨关节炎的COMP肽和抗体技术领域本发明涉及肽和针对该肽的抗体，及其在诊断，特别是全身性炎性疾病，特别是骨关节炎和心血管疾病的诊断中的用途。背景技术动脉粥样硬化与全身性低级别慢性炎症和随后血管中炎性斑块的形成有关，并且是西方世界的主要死亡原因之一。动脉粥样硬化从较不危险的无症状阶段缓慢进展到斑块发展至斑块可能引起血栓形成的阶段，血栓形成可能阻塞毛细血管，从而导致心脏病发作或中风。在晚期阶段，动脉粥样硬化经常进展到颈动脉狭窄，颈动脉狭窄是由斑块引起的颈动脉内表面变窄。在这个阶段，血栓形成和栓塞释放引起中风的风险非常高。今天不可能监测动脉粥样硬化如何进展到危险阶段。颈动脉狭窄通常通过使用具有中等敏感性和特异性的超声来诊断。因此，需要监测动脉粥样硬化进展为颈动脉狭窄的方法。骨关节炎OA是一种低级别慢性全身性炎症，由关节软骨和下方骨质的破坏引起。该疾病从早期阶段开始，其通常以炎症为特征并且在受影响的关节中开始基质蛋白的解体，到更严重的阶段，对下面的骨骼造成损害。主要症状是关节疼痛。骨关节炎是一个主要的临床问题，因为它影响了约3.8％的人口。据估计，50％的NSAID止痛药处方与OA有关。虽然关节疼痛经常导致医生怀疑是OA，特别是如果患者是老年人，现在很难诊断OA的早期阶段。今天诊断通常基于使用放射学识别OA晚期典型的不可逆结构损伤。然而，X射线或MRI不能用于诊断早期OA，因为结构损伤尚不可见。此外，X射线和MRI检查需要昂贵的设备，并与放射科医生预约。对于马主来说，马的骨关节炎是一个很大的问题。拥有一匹马的主要原因是能够使用它，并经常用它参加比赛。OA是不能使用马的最常见原因，并且是马业中最大的单一经济损失。马的早期OA经常表现为跛足，即异常的步态或姿势。跛足通常很微妙，能有一种改进的监测跛足的方法将是有用的。这将使马主能够知道何时由于跛足而停止训练和比赛，让马匹休息。马和人类的OA是由类似的机制引起的。在人和马中，OA从早期阶段进展，其特征在于炎症持续数月和数年至具有广泛组织损伤的后期Goldring,M.B.andOteroM.CurrentOpinioninRheumatology2011235:471。人和马的OA疾病机制在分子水平上也非常相似StenbergJ,RüetschiU,LindahlA.ProteomeSci.2013Oct4；111:43StenbergJ,RüetschiU,E,J,LindahlA.ProteomeSci.2013Oct4；111:43SGalaE,M,SihlbomC,RüetschiU,LindahlA,EkmanS,E.ConnectTissueRes.2015；564:315-25。缺乏OA的早期标志物阻碍了可用于在疾病表现为不可逆的组织损伤之前控制疾病的药物的开发。如果有更方便的诊断和分期OA的方法将是有用的。本发明解决了这些和其他问题。发明内容在本发明的第一方面，提供了特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的抗体。该抗体可用于诊断。因此，在第二方面，提供了特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的抗体在诊断中的用途。该诊断可以是与全身性炎症相关的疾病的诊断，特别是全身性低级别慢性炎症，例如骨关节炎，特别是早期骨关节炎或动脉粥样硬化，特别是颈动脉狭窄。诊断也可以是动脉硬化的诊断。诊断还可以是神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、肌萎缩侧索硬化症ALS、或神经炎性疾病、例如多发性硬化症、帕金森病、格林-巴利综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、自身免疫性脑炎或发作性睡病的诊断。该抗体可用于检测来自受试对象的样品中包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的量。在优选的实施方案中，所述样品是滑液、血液、血清或血浆的样品。本发明提供了用于全身性低级别慢性炎性疾病如动脉粥样硬化和OA的生物学标记物。因此，可以以比以前更方便的方式监测这些疾病。通过使用本发明的抗体测试滑液样品，可以在早期发现OA。这有几个优点。这将有助于发现和监测OA，并可能促进OA的药物开发。通过使用本发明的抗体测试血液样品可以检测晚期动脉粥样硬化。在优选的实施方案中，受试对象是人，疾病是动脉粥样硬化，并且样品是血液样品。在优选的实施方案中，受试对象是马，疾病是OA，特别是早期OA或急性跛行，并且该样品是滑液样品。在第三方面，提供了根据本发明第一方面的抗体用于诊断。在本发明的第四方面，提供了一种诊断方法，包括从受试对象中分离样品并分析样品中包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽在样品中的存在或量。在本发明的第五方面，提供了一种诊断试剂盒，其包含如上所述的抗体。在本发明的第六方面，提供了包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽。在本发明的第七方面，提供了包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽用于产生抗体的用途。附图说明图1使用连续稀释的对照肽SEQIDNO4或SGPTHEGVC肽SEQIDNO3测试抗-N-SGPTH抗体的特异性。图2是显示来自马的滑液样品中包含序列N-末端SGPTH的肽的浓度的图*＝p4周持续时间，D无跛行病史和具有正常形态的关节健康对照，或E存在晚期OA的关节。生物样本库I包括28匹年轻的标准育种STB快步马13匹小雌马和15匹小雄马，由同一个园区的同一名培训师培训。这些马在平均年龄为19.5个月开始训练，在平均年龄为40个月结束。所有的马都是临床健康的，并且在六个时机访问1,2,3,4,5和6进行检查。在SF取样时，进行了包括放射线照相和腕关节闪烁扫描在内的屈曲试验的临床跛行检查。生物样本库II由STB的左腕关节和瑞典温血马SWHs组成，这些马在一个屠宰场被实施安乐死。来自左侧腕骨间关节的SF在死后立即取样。关节软骨的特征在于第三腕骨的近端关节表面正常或具有结构性OA损伤。生物样本库III由来自临床跛足马的SF组成。在包括屈曲试验和关节内麻醉的常规跛行检查期间检查马。该检查还包括用于评估麻醉前后跛足的跛行定位器测试。根据临床跛行评估，从不同关节收集SF。该样本库由来自通过关节内麻醉和跛行定位器确定在特定关节中具有跛足的关节的SF组成。图2中使用的材料是中部腕关节和系关节的SF，它们来自：关节软骨目视正常的马作为健康对照n＝8，生物样本库II；关节软骨的轻度至中度结构性OA变化的晚期OA的马n＝8，生物样本库II；早期OA急性跛行4个月的马n＝9，生物样本库III；以及来自年轻健康的训练中的赛马作为健康对照n＝7，生物样本库I。开发抑制ELISA以定量SF中肽的浓度。用在0.1M碳酸盐缓冲液pH9.6中稀释的4.0μgmL肽序列SGPTHEGVC，SEQIDNO3包被NUNC板，并在4℃温育过夜。使用含有0.6％BSA和0.8％SDS的10mMPBS中的5.0μgmL肽序列SGPTHEGVGMASEQIDNO5的连续稀释物作为校准曲线范围＝5～0.078μgmL。在含有0.84％SDS的PBS中1:20稀释SF样品。将一式几份标准品和SF在96孔Sterilin板中于25℃温育过夜。第二天，将第一抗-SGPTH抗体在含有1％BSA和4％Triton-X-100的PBS中1:2000稀释加入Sterilin板中，将板在25℃温育1小时20分钟。在25℃洗涤NUNC板并用含有1％BSA和0.1％吐温的PBS封闭1小时。在25℃，将总共100μL从Sterilin板转移至NUNC板，并在25℃温育1小时。温育后，洗涤NUNC板，并且加入在含有1％BSA和0.1％吐温的PBS中1:20000稀释的第二抗体山羊抗-兔IgGH&L[HRP]。将板在25℃温育1小时，然后洗涤6次并与底物SubstrateReagentPackDY999，R&DSystem，UK一起在25℃温育约8分钟。加入终止溶液1MH2SO4，并在450nm测量吸光度SpectraMaxPlus384，MDSAnalyticalTechnologiesLtd，UK。与健康对照关节和具有慢性骨关节炎慢性跛行和或具有晚期骨关节炎的马的关节相比，具有早期骨关节炎急性跛行的马的滑液中的肽浓度在统计学上增加图2。数据表示为平均值±SD，并且使用GraphPadPrism6GraphPadSoftwareInc，SanDiego，CA，USA通过单向ANOVA评估平均值之间的差异。为了进行组间比较，进行了Turkey的多重比较测试。显著性水平设定为p伊娃·斯蔻德布兰德安德斯·林达尔斯蒂娜·艾克曼用于诊断骨关节炎的COMP肽和抗体6SIPOSequenceListing1.015PRT马Equuscaballus1SerGlyProThrHis1529PRT人工序列artificialsequenceDOMAIN用于免疫的肽2SerGlyProThrHisGlyGlyGlyCys1539PRT马Equuscaballus3SerGlyProThrHisGluGlyValCys15415PRT马Equuscaballus4ProProGlyTyrSerGlyProThrHisGluGlyValGlyMetCys151015511PRT马Equuscaballus5SerGlyProThrHisGluGlyValGlyMetAla1510611PRT人Homosapiens6SerGlyProThrHisGlnGlyValGlyLeuAla1510

权利要求：1.一种抗体，其特异性结合包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽。2.根据权利要求1所述的抗体，其用于诊断。3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述诊断是受试对象的骨关节炎、动脉粥样硬化、神经变性疾病或神经炎性疾病的诊断。4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述诊断是骨关节病的诊断。5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述骨关节病是早期骨关节炎。6.根据权利要求3所述的抗体，其中所述诊断是动脉粥样硬化的诊断。7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述动脉粥样硬化是颈动脉狭窄。8.根据权利要求3所述的抗体，其中所述神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、肌萎缩侧索硬化症ALS，或者其中所述神经炎性疾病选自下组：多发性硬化症、帕金森病、格林-巴利综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、自身免疫性脑炎和发作性睡病。9.根据权利要求3至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体用于检测来自受试对象的样品中包含氨基酸序列N末端-SGPTH的肽的量。10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述样品是滑液、脊髓液液体、血清、血液或血浆的样品。11.根据权利要求1所述的抗体在诊断中的用途。12.一种诊断方法，包括从受试对象中分离样品并分析该样品中包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽的存在或量。13.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的抗体。14.包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽。15.包含氨基酸序列N-末端-SGPTH的肽用于产生抗体的用途。

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