申请/专利权人：东莞理工学院

申请日：2021-11-17

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN113984935B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2022.02.18#实质审查的生效;2022.01.28#公开

摘要：本发明公开了基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，本发明采集产乙酸嗜蛋白菌从生长初期到生长稳定期的菌液，通过液相色谱‑质谱联用技术确定主要代谢物成分，通过对高质量数据的比较，进一步分析得到产乙酸嗜蛋白菌生长中的差异代谢物，通过对差异代谢物之间的相关性分析和富集通路分析，根据显著富集通路中的差异代谢物转换路径，明确产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性，本申请能够为了解产乙酸嗜蛋白菌的生理学过程提供一个重要途径，为从分子水平研究微生物功能提供新思路，并为细菌类的代谢组学研究提供一种可行方案，为产乙酸嗜蛋白菌代谢调控机制的研究提供突破口。

主权项：1.基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：制备培养液，将产乙酸嗜蛋白菌接种至培养液中，使用甲醇提取法处理菌液样本以及对照样本，并设置质控样本；其中，培养液的制备方法为：将5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL微量元素原液和1L蒸馏水混合均匀，调节pH至7.2；甲醇提取法为：用80％冷甲醇配制浓度为1mgmL的2-氯-L-苯丙氨酸作为内标液，在菌液样本中加入4μL的1mgmL的2-氯-L-苯丙氨酸，在菌液样本和对照样本中分别加入296μL的80％冷甲醇，涡旋10s，冰水浴中超声10min，重复3次，在-20℃下静置0.5h，在4℃，15000g离心力下离心10min，收集上清液，所述冷甲醇中均含有0.1％甲酸；S2：将菌液样本和质控样本进样，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据A，将对照样本进样，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据B；设定液相色谱-质谱联用技术的测试方法，具体为：（1）色谱条件：色谱柱为BEHC18柱，100mm×2.1mmi.d.，1.7μm，waters；正离子模式：流动相A，0.1％甲酸，流动相B，乙腈；负离子模式：流动相A，乙酸铵，流动相B，乙腈；梯度洗脱程序为初始5％B，3min至20％，至9min线性增长至95％，保持4min，0.1min后恢复至5％B，平衡至16min；样品池温度：15℃；柱温：40℃；流速：0.2mLmin；进样量10μL；（2）质谱条件：样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式；扫描范围：70-1050mz；喷涂电压为3.2kV；MSMS二级扫描：ddMS2；S3：对质谱分析得到的原始数据A、原始数据B进行分析，将菌液样本和对照样本中检测到的色谱峰进行积分，用总峰面积对相对定量结果标准化，得到代谢物的相对定量结果，设置筛选条件进行初筛，得高质量数据A和高质量数据B；S4：采用PLS-DA模型对高质量数据A和高质量数据B进行比较，根据PLS-DA模型中的筛选条件，筛选出产乙酸嗜蛋白菌的差异代谢物；其中，总差异代谢物有L-Leucine、L-Valine、L-Isoleucine、L-Threonine、L-Phenylalanine、L-Histidine、L-Glutamicacid、L-Ornithine、Choline、Glycyl-L-leucine、Adenosine、Spermine、Guanine和Cytosine；S5：对差异代谢物进行相关性分析和差异代谢物的路径分析，得到产乙酸嗜蛋白菌的显著富集通路，根据显著富集通路中的差异代谢物转换路径，明确产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。

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