申请/专利权人：兰州大学

申请日：2017-01-13

公开（公告）日：2020-09-01

公开（公告）号：CN107058494B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.01#授权;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开

摘要：本发明属于农业牧草育种与应用技术领域，一种采用SCoT分子标记高效、科学的进行箭筈豌豆种质资源纯度鉴定的方法。一种采用SCoT分子标记简化箭筈豌豆品种纯度的鉴定方法，其主要特点在于包括如下步骤：1箭筈豌豆种质DNA提取；2采用SCoT引物对步骤1的箭筈豌豆种质DNA进行PCR扩增；3对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳拍照；4比较箭筈豌豆种质多态性位点的差异，确定箭筈豌豆品种纯度鉴定结果。本发明使用的检测方法可在6h内完成种子品种纯度的鉴定工作，具有科学、高效、价廉、操作简单等优势。可为箭筈豌豆品种纯度鉴定、新品种选育、以及品种的真实性、稳定性和特异性鉴定提供有力的技术支持。

主权项：1.一种采用SCoT分子标记简化箭筈豌豆品种纯度的鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1箭筈豌豆种质DNA提取：随机取样，采用改进后的CTAB法提取待测种质基因组DNA备用；2采用SCoT引物对步骤1的箭筈豌豆种质DNA进行PCR扩增，其中PCR扩增反应的总体积是10μl，扩增反应体系为：2×PowerTaqPCRMasterMix5.0μl，SCoT引物分别为1μl，包括Scot28引物：5'-CCATGGCTACCACCGCCA-3'为1μl；Scot35引物：5'-CATGGCTACCACCGGCCC-3'为1μl'；Scot36引物：5'-GCAACAATGGCTACCACC-3'为1μl；Scot37引物：5'-ACGACATGGCGACCAGCG-3'为1μl；Scot38引物：5'-ACGACATGGCGACCACCG-3为1μl，步骤1箭筈豌豆种质DNA50ngμl，2.0μl，ddH202μl；PCR扩增反应程序为94℃预变性4min；35个扩增循环：94℃变性1min，退火1min，72℃延伸2min；72℃延伸7min；4℃保存；3对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2-1.4％，凝胶组分为琼脂糖6.1-7.1g，ddH20450ml，10×TBE50ml，核酸染料9-12μl；跑胶电压129-132V，电泳时间2h15min-2h30min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相；4比较箭筈豌豆种质多态性位点的差异，确定箭筈豌豆品种纯度鉴定结果，箭筈豌豆种质平均多态性位点为21.4-27.4，通过统计0,1矩阵，统计等位基因数，计算观测杂合度，观测杂合度Ho＝观察得到杂和个体数样本个体数总数，Ho均为100％，所统计位点均为多态性位点，等位基因保留比例大于85％可代表该种质大部分遗传信息,品种纯度为合格。

全文数据：采用SCoT分子标记简化箭害豌豆品种纯度鉴定的方法技术领域[0001]本发明属于农业牧草育种与应用技术领域，一种采用分子标记高效、科学的进行箭菩豌豆种质资源纯度鉴定的方法。背景技术[0002]近年来，随着牧草种质资源的发展，牧草育种越来越受到学者重视，培育推广新的牧草品种是我国牧草育种发展的重要方向。现阶段而言，牧草育种方式主要有田间育种及分子手段育种两种方式，以分子手段育种为主;但是，因为分子育种技术的参差不齐，导致繁育的牧草种质质量良莠不齐，无法保证种质资源的纯度。因此，牧草新品种纯度的鉴定至关重要，这不仅是对新品种的保护与审定，也是区分假劣种子，维护培育者自主知识产权的重要手段。因此，研发科学、高效的牧草品种纯度鉴定方法，是高校企业重点关注的研究课题。[0003]箭菩豌豆是一年生豆科闭花授粉牧草，广泛种植于我国西北、华北地区，具有抗寒旱性强、地域适应力广、有较高营养价值、可做高原地区青贮饲料，是我国牧草资源中品质优良的牧草作物，在我国草地农业系统中发挥重要的作用，具有广阔的育种前景。由于牧草种质资源繁多，不同种质之间的纯度差异直接影响了种质资源的使用和保护，因此对种质纯度的鉴定工作显得尤为重要，与此同时新种质资源的登记及纯度和遗传特性分析都需要比田间测试更准确、更高效、更低廉以及更简便的分子水平种质纯度的鉴定方法。[0004]近年来，随着分子生物学和功能基因学研究的发展，功能性的分子标记愈来愈受到学者们的重视，因其本身可能含有目的基因的一部分或与目的基因紧密联锁，这样通过对某个分子标记的筛选即能对性状进行筛选，从而加快种质育种进程。现如今已经挖掘和开发出许多种分子标记方法如3即、1^?0、331?、1331?和4?1^等，这些分子标记技术已经广泛应用于物种遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱构建、QTL定位、基因定位克隆、转基因植物鉴定及分子辅助育种等方面。[0005]SCoT分子标记，即目标起始密码子多态性（StartcodontargetedpoIymorphism标记。该分子标记能够利用植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼的序列保守性，得到所需的单个引物，并扩增对应目标基因组，进而发生显性的多态性标记，与其他分子标记相比，SCoT分子标记具有操作简便、价格低廉、重复性好、多态性丰富等优点，目前该分子标记已成功应用于老芒麦薛德，2015、大豆李强，2013、龙眼（陈虎，2010、柑橘韩国辉，2011、药用菊花赵瑞强，2009，并在物种构建遗传图谱、特异性状标记、基因组学比较等方面得到广泛应用。但是，该分子标记技术在箭菩豌豆品种纯度鉴定方面的应用未见报道。发明内容[0006]本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种采用SCoT分子标记简化箭菩婉ϋ品种纯度鉴定引物。[0007]本发明的目的二是提供一种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定试剂盒。[0008]本发明的目的三是提供一种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定的方法。[0009]以此对箭菩豌豆种质纯度进行高效准确的鉴定。此分子标记方法科学，高效，便捷，在实验室条件下6h之内即可完成。在本发明中，实验所用的4个箭菩豌豆种质均适用，说明该方法具有很强的实用性和应用价值，适合推广使用，有利于广大种检人员快速准确的鉴定种质纯度。本发明在我国牧草产业发展中，具有广泛的应用前景，为我国的饲草种质安全提供重要保障，保证了培育者的切身利益，为牧草种质资源的发展提供了有力的技术支持。[0010]本发明目的基于分子标记最新的研究成果，挖掘SCoT分子标记的检测技术，对箭菩豌豆的多个种质进行鉴定，公开了一种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种鉴定的方法。[0011]为实现以上目的，本发明提供如下的技术方案:一种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定引物，其主要特点在于引物为：[0012]5。〇七28引物：5’-〇^丁660^0^01；0^-3’；[0013]5。〇七35引物：5’-〇八丁660^0^01^〇0：-3’；[0014][0015]Scot37引物：5’-ACGACATGGCGACCAGCG-3’；[0016][0017]—种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定试剂盒，其主要特点在于PCR扩增体系2XPowerTaqPCRMasterMix，SCoT弓|物包括Scot28弓|物：5’-CCATGGCTACCACCGCCA-3’；Scot35引物：5’-CATGGCTACCACCGGCCC-3’；Scot36引物：5’-GCAACAATGGCTACCACC-3’；Scot37引物：5’-ACGACATGGCGACCAGCG-3’；Scot38引物：5’-ACGACATGGCGACCACCG-3〇[0018]—种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，其主要特点在于包括如下步骤：[0019]1箭菩婉ϋ种质DNA提取:随机取样，米用改进后的CTAB法陈昆松，2004提取待测种质基因组DNA备用；[0020]⑵采用SCoT引物对步骤⑴的箭菩豌豆种质DNA进行PCR扩增，其中PCR扩增反应的总体积是1〇μ1，扩增反应体系为：2XPowerTaqPCRMasterMix5.0yl，SCoT引物分别为Ιμΐ，包括Scot28引物：5’-CCATGGCTACCACCGCCA-3’为Ιμΐ;[0021]Scot35引物：5，-CATGGCTACCACCGGCCC-3，为Ιμΐ;[0022]Scot36引物：5，-GCAACAATGGCTACCACC-3，为Ιμΐ;[0023]Scot37引物：5，-ACGACATGGCGACCAGCG-3，为Ιμΐ;[0024]Scot38引物：5’-ACGACATGGCGACCACCG-3为Ιμΐ，步骤（1箭菩豌豆种质DNA50ngy1，2.Ομί，CldH2O2μ1;PCR扩增反应程序为94°C预变性4min;35个扩增循环:94°C变性Imin，退火lmin，72°C延伸2min;72°C延伸7min;4°C保存；[0025]3对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2-1.4%，凝胶组分为琼脂糖6·1-7·lg，ddH20450ml，10XTBE50ml，核酸染料9-12μ1;跑胶电压129-132V，电泳时间2hl5min-2h30min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相；[0026]⑷比较箭菩婉ϋ种质多态性位点的差异，确定箭菩婉ϋ品种纯度鉴定结果，箭菩豌豆种质平均多态性位点为21.4-27.4,通过统计0，1矩阵，统计等位基因数，计算观测杂合度，观测杂合度Ho=观察得到杂和个体数样本个体数总数，Ho均为100%，所统计位点均为多态性位点，等位基因保留比例大于85%可代表该种质大部分遗传信息，品种纯度为合格。[0027]所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，其步骤4还包括确定引物的等位基因数，按照对应待测品种的PCR扩增产物片段大小统计0，1矩阵，得到相应等位基因数，根据统计的等位基因按计算公式计算多态信息含量PIC，其中:η为等位基因数目；P1和匕分别为第i和第j个等位基因的频率;在相同迀移位置上进行“〇，Γ统计，构建箭菩豌豆种质的SCoT分析谱带数据，通过数据分析所用引物是否对箭菩豌ϋ种质进彳丁完全区分。[0028]所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，还包括所述的每个箭菩豌豆种质最佳取样数为10个单株。[0029]本发明通过对供试箭菩豌豆进行DNA提取，PCR扩增和SCoT分析，确认该技术在箭菩豌豆种质间的多态性表达，可以高效准确的对箭菩豌豆种质纯度进行鉴别。[0030]本发明采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法与现有鉴定技术相比所具有的优势在于:弥补了原有鉴定方法检测周期长的缺点，仅经过一次扩增反应就可得到多个多态性标记对箭菩豌豆种质纯度进行鉴别，具有科学准确的优势，提高了检测效率，降低了试验成本，操作方法便捷。附图说明[0031]图I.SCoT引物用于4个箭菩豌豆种质各种质随机取样10株时扩增产物的电泳分析图谱；[0032]图中：从左至右依次为兰箭1号、箭菩豌豆17号、兰箭3号、箭菩豌豆33号。[0033]图2.SCoT引物用于4个箭菩豌豆种质各种质随机取样10株时SCoT谱带分析聚类图；[0034]图中：4个箭菩豌豆随机取样单株均按种质聚在一起，从上到下依次为兰箭3号、箭菩豌豆33号、兰箭1号、箭菩豌豆17号。[0035]图3.SCoT引物用于4个箭菩豌豆种质各种质随机取样60株时SCoT谱带分析聚类图；[0036]图中：4个箭菩豌豆随机取样单株均按种质聚在一起，从上到下依次为兰箭1号、箭菩豌豆17号、兰箭3号、箭菩豌豆33号。[0037]具体实施方法[0038]为能更详细的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细说明，本发明所述的引物序列见表1，试验中用到的其他试剂市场上均有售。以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[0039]实施例1:一种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定引物，其主要特点在于引物为：[0040]Scot28引物：5，-CCATGGCTACCACCGCCA-3’；[0041]5。〇七35引物：5，-〇八丁660^0^01^〇0：-3’；[0042]Scot36引物：5，-GCAACAATGGCTACCACC-3，；[0043]Scot37引物：5，-ACGACATGGCGACCAGCG-3’；[0044]Scot38引物：5’-ACGACATGGCGACCACCG-3’。[0045]实施例2:—种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定试剂盒，其主要特点在于PCR扩增体系2XPowerTaqPCRMasterMix，SCoT引物包括Scot28引物：5’_CCATGGCTACCACCGCCA-3’；Scot35引物：5’-CATGGCTACCACCGGCCC-3’；Scot36引物：5’-GCAACAATGGCTACCACC-3’；Scot37引物：5’-ACGACATGGCGACCAGCG-3’；Scot38引物：5’-ACGACATGGCGACCACCG-3〇[0046]实施例3:—种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，其主要特点在于包括如下步骤：[0047]4个箭菩豌豆种质取样及DNA提取方法为：随机取样，每个种质按1、2、3、5、8、10、20、30、40、50、60共11个梯度采取单株，取嫩叶部分50-100mg研钵研磨，利用改进后的CTAB法提取DNA陈昆松，2004,DNA提取后浓度统一稀释至50±lngμΐNanoDropProducts，Wilmington,DE,USA〇[0048]DNA提取方法也可以按市场上销售的试剂盒进行。[0049]供试箭菩豌豆种质PCR方法为：[0050]1用于4个箭菩豌豆种质鉴定的引物序列：[0051]5。〇七28引物：5，-〇^丁660^0^01；0^-3’；[0052]5。〇七35引物：5，-〇八丁660^0^01^〇0：-3，；[0053]Scot36引物：5，-GCAACAATGGCTACCACC-3，；[0054]Scot37引物：5，-ACGACATGGCGACCAGCG-3，；[0055]Scot38引物：5，-ACGACATGGCGACCACCG-3，。[0056]2采用上述SCoT引物对供试品种DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积是1〇μ1，扩增反应体系为：2XPowerTaqPCRMasterMix5.0yl，SCoT引物Ιμΐ，供试箭菩豌豆种质DNA50ngAU，2.Ομί，ddH202μ1;PCR反应程序为94°C预变性4min;35个扩增循环：94°C变性lmin，退火lmin，72°C延伸2min;72°C延伸7min;4°C保存；[0057]3对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.4%，凝胶组分为琼脂糖6.4g，ddH20450ml，10XTBE50ml，核酸染料12μ1，；跑胶电压129V，电泳时间2hl5min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相。[0058]4通过对SCoT结果分析，比较4个箭菩豌豆种质多态性位点的差异，确定引物的等位基因数和多态信息含量;在相同迀移位置上进行“〇，Γ统计，构建4个箭菩豌豆种质的SCoT分析谱带数据，通过数据分析引物是否对4个箭菩豌豆种质进行完全区分，同时构建4个箭菩豌豆种质的聚类图并根据等位基因保留比例找到鉴定种质纯度所需的最佳取样数。等位基因保留比例大于85%可代表该种质大部分遗传信息，品种纯度为合格。[0059]在不计算DNA提取耗时的前提下，本发明的鉴定方法PCR耗时2h45min，SCoT分析2hl5min，即6h之内即可完成对箭菩豌豆种质的鉴定工作。仅经过一次扩增就可得到多个多态性标记对箭菩豌豆种质进行鉴别，提高了试验效率，降低了试验成本，操作方法便捷。本发明的鉴定方法可对箭菩豌豆种子的纯度进行甄别，起到保护牧草种质资源，防止假劣种质流入市场的作用，同时也为牧草新品种的选育及种质遗传多样性分析提供技术支持。[0060]实施例4:所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，其步骤4还包括确定引物的等位基因数，按照对应待测品种的PCR扩增产物片段大小统计0，1矩阵，得到相应等位基因数，根据统计的等位基因按计算公式计算多态信息含量PIC，其中：η为等位基因数目；Pi和Pj分别为第i和第j个等位基因的频率;在相同迀移位置上进行“0，Γ统计，构建箭菩豌豆种质的SCoT分析谱带数据，通过数据分析所用引物是否对箭菩豌豆种质进行完全区分。其余步骤与实施例3相同。[0061]实施例5:所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，还包括所述的每个箭菩豌豆种质最佳取样数为10个单株。其余步骤与实施例3相同。[0062]实施例6:所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，步骤3对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2%，凝胶组分为琼脂糖6.lg，ddH20450ml，IOXTBE50ml，核酸染料9μ1;跑胶电压129V，电泳时间2hl5min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相;其余步骤与实施例3相同。[0063]实施例7:所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，步骤3对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.4%，凝胶组分为琼脂糖7.lg，ddH20450ml，10XTBE50ml，核酸染料12μ1;跑胶电压132V，电泳时间2h30min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相;其余步骤与实施例3相同。[0064]试验例1:[0065]⑴试验样品：兰箭1号种质兰州）、兰箭3号种质兰州）、箭菩豌豆17号种质似色列引进）、箭菩豌豆33号种质（比利时引进）；[0066]2试验用试剂：北京索莱宝公司2XPowerTaqPCRMasterMix溶液；上海生工合成的5条SCoT引物；[0067]3SCoT引物序列表如下：[0068][0069]。.[0070]⑷箭菩豌豆取样及DNA提取箭菩豌豆种质取样及DNA提取方法为:随机取样，每个种质按60株取样，取嫩叶部分50-100mg研钵研磨，利用改进后的CTAB法陈昆松，2004提取DNA,DNA提取后浓度统一稀释至50±lngμΐNanoDropProducts，Wilmington，DE,USA。[0071]注:DNA提取方法也可以按市场上销售的试剂盒进行。[0072]5PCR扩增反应[0073]按表1所示的SCoT引物对供试品种DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积是1〇μ1，扩增反应体系为：2XPowerTaqPCRMasterMix5.0yl，SCoT引物lylScot28引物、Scot35引物、Scot36引物、Scot37引物、Scot38引物各Ιμΐ，供试箭菩豌豆种质DNA50ngAU，2.Ομί，CldH2O2μ1;PCR反应程序为94°C预变性4min;35个扩增循环：94°C变性lmin，退火lmin，72°C延伸2min;72°C延伸7min;4°C保存；[0074]⑶琼脂糖凝胶电泳[0075]对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.4%，凝胶组分为琼脂糖6.4g，ddH20450ml，10XTBE50ml，核酸染料12μ1，；跑胶电压129V，电泳时间2hl5min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相。（见图1[0076]⑵SCoT谱带分析[0077]利用5条SCoT引物对4个箭菩豌豆种质进行有效扩增，在相同迀移率位置上进行“1，〇”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为〇,构建出5条SCoT引物4个箭菩豌豆种质的SCoT分析谱带数据。从所得的数据可以看出，5条SCoT引物可以把4个箭菩豌豆种质完全区分开，且通过对等位基因保留比例计算，发现随机取样10株时等位基因保留比例大于等于90%，一般来说保留比例大于85%可代表该种质大部分遗传信息。这说明各种质只需随机取样10株即可完成对种质纯度的鉴定。利用这一套科学、高效、便捷的箭菩豌豆纯度鉴别方法，可对箭菩豌豆种子的纯度进行评估和鉴别，起到保护牧草种质资源，防止假劣种质流入市场的作用，同时也为牧草新品种的选育及种质遗传多样性分析提供技术支持。[0078]图3.SCoT引物用于4个箭菩豌豆种质各种质随机取样60株时SCoT谱带分析聚类图。[0079]为了更加清晰的说明本发明的鉴定方法，下面对本发明的试验方法进行详细说明。[0080]1、原理[0081]SCoT分子标记，即目标起始密码子多态性（Startcodontargetedpolymorphism标记。属于单引物扩增，该分子标记根据保守的起始序列来设计引物，由于翻译的起始区都有ATG+1、+2和+3序列的起始密码子，以基因的5’端为起点，紧跟着是一个G+4，+7、+8、+9位分别为六、：、：，这7个核苷酸是固定的，其余位置均为补充序列，而该分子标记的多样性就出现在此序列。扩增的是2个基因间的区域，其引物总长度18bp。利用通用引物序列合成引物，对研究材料进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，通过对特异性条带的统计分析，确认是否可以对4个箭菩豌豆种质进行区分，并找到鉴定不同种质的纯度所需的最佳取样数。[0082]2、引物设计[0083]由上海生工合成20条引物，经过优化筛选最终获得5条可以清晰高效对箭菩豌豆品种纯度进行鉴定的引物。[0084]引物由上海生物工程公司合成。[0085]表1引物序列表如下：[0086][0087]3、箭菩婉ϋ取样及DNA提取[0088]4个箭菩豌豆种质取样及DNA提取方法为：随机取样，每个种质按1、2、3、5、8、10、20、30、40、50、60共11个梯度采取单株，取嫩叶部分50-100mg研钵研磨，利用改进后的CTAB法提取DNA,DNA提取后浓度统一稀释至50±lngμΐNanoDropProducts，Wilmington,DE,USA〇[0089]注:DNA提取方法也可以按市场上销售的试剂盒进行。[0090]4、PCR扩增反应[0091]扩增反应采用表1引物序列。PCR扩增反应的总体积是10μ1，扩增反应体系为:2XPowerTaqPCRMasterMix5.0yl，SCoT引物Ιμΐ，供试箭菩碗豆种质DNA50ngyl，2.0yl，ddH2〇2yl;PCR反应程序为94°C预变性4min;35个扩增循环:94°C变性lmin，退火lmin，72°C延伸2min;72°C延伸7min;4°C保存；[0092]5、琼脂糖凝胶电泳[0093]对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.4%，凝胶组分为琼脂糖6.4g，ddH2〇450ml，10XTBE50ml，核酸染料12μ1，；跑胶电压129V，电泳时间2hl5min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相。[0094]6、SCoT谱带分析[0095]通过对SCoT结果分析，比较4个箭菩豌豆种质多态性位点的差异，确定引物的等位基因数和多态信息含量;在相同迀移位置上进行“〇，Γ统计，构建4个箭菩豌豆种质的SCoT分析谱带数据，通过数据分析引物是否对4个箭菩豌豆种质进行完全区分，同时构建4个箭菩豌豆种质的聚类图谱并根据等位基因保留比例找到鉴定种质纯度所需的最佳取样数。从所得的数据可以看出，5条SCoT引物可以把4个箭菩豌豆种质完全区分开，且通过对等位基因保留比例计算，发现随机取样10株时等位基因保留比例大于等于90%，一般来说保留比例大于85%可代表该种质大部分遗传信息。这说明各种质只需随机取样10株即可完成对种质纯度的鉴定。[0096]表2.4个箭菩豌豆种质按梯度随机取样等位基因数及保留比例变化表。[0097][0098]表中：在4个种质随机取样数分别为10株时，保留比例多90%。[0099]试验例2:—种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法。该方法以4个箭菩豌豆品种的单株基因组DNA为模板，20条SCoT引物为候选引物。[0100]由上海生工合成20条引物，经过优化筛选最终获得5条可以清晰高效对箭菩豌豆品种纯度进行鉴定的引物。[0101]引物由上海生物工程公司合成。[0102]20条引物引物引物序列（5’-3'退火温度ΓΓΊScol25ACCATGGCTACCACCGGG6ί.9[0103]Scot26ACCATGGCTACCACCGTC59.6Scol27ACCATGGCTACCACCGTG59.6Scol28CCATGCKTACCACCGCCA61.9Scoi29CCATGGCTACCACCGGCC64.1ScoGOCCATGGCTACCACCGGCG64.1Scxi34ACCATGGCTACCAC.CGCA59,6Scoi35CATGGCTACCACCGGCCC64.1Scoi36GCAACAATGGCTACCACC57.:3Scoi37ACGACATGGCGACCAGCG61.9Scot38ACGACATGGCGACCACCG61.9[0104]Sc〇t.39AACCAKjGCTACCACCGC59.6Scoi40CAATGGCTACCACTACAG55.0Scot41CAATGGCTACCACTGACA55.0Scot42CAATGGCTACCATTAGCG55.0Sc'〇l44CAATGGCTACCATTAGCC55.0Scol45ACAATGGCTACCACTGAC55.0Scot54ACAATGGCTACCACCAGC57.3Scot59ACAATGGCTACCACCATC55.0Scot60ACAATGGCTACCACCACA55.0[0105]步骤与5条引物的实验步骤一样，目的是全部跑电泳，根据电泳图查看，得到条带清晰，重复性好，多态性差异明显的引物。经过优化，发现下述5条引物条带清楚、多态性高，可以鉴别4份箭菩豌豆种质的遗传差异。[0106]5。〇七28引物：5，-〇^丁660^0^01；0^-3’；[0107]5。〇七35引物：5，-〇八丁660^0^01^〇0：-3，；[0108]5。〇七36引物：5，-6〇八八〇八八丁660^0^0：-3，；[0109]Scot37引物：5，-ACGACATGGCGACCAGCG-3’；[0110][0111]试验例3:⑴试验样品：兰箭1号种质（兰州）、兰箭3号种质（兰州）、箭菩豌豆17号种质似色列引进）、箭菩豌豆33号种质（比利时引进）；[0112]2试验用试剂:北京索莱宝公司2XPowerTaqPCRMasterMix溶液;上海生工合成的5条SCoT引物；[0113]3SCoT引物序列表如下：[0114][0115]⑷箭菩豌豆取样及DNA提取箭菩豌豆种质取样及DNA提取方法为:随机取样，每个种质按I〇株取样，取嫩叶部分50-1OOmg研钵研磨，利用改进后的CTAB法陈昆松，2004提取DNA,DNA提取后浓度统一稀释至50±lngμΐNanoDropProducts，Wilmington，DE,USA。[0116]注:DNA提取方法也可以按市场上销售的试剂盒进行。[0117]5PCR扩增反应[0118]按表1所示的SCoT引物对供试品种DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积是1〇μ1，扩增反应体系为：2XPowerTaqPCRMasterMix5.0yl，SCoT引物lylScot28引物、Scot35引物、Scot36引物、Scot37引物、Scot38引物各Ιμΐ，供试箭菩豌豆种质DNA50ngAU，2.Ομί，CldH2O2μ1;PCR反应程序为94°C预变性4min;35个扩增循环：94°C变性lmin，退火lmin，72°C延伸2min;72°C延伸7min;4°C保存；[0119]⑶琼脂糖凝胶电泳[0120]对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.4%，凝胶组分为琼脂糖6.4g，ddH20450ml，10XTBE50ml，核酸染料12μ1，；跑胶电压129V，电泳时间2hl5min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相。[0121]⑵SCoT谱带分析[0122]利用5条SCoT引物对4个箭菩豌豆种质进行有效扩增，在相同迀移率位置上进行“1，〇”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为〇,构建出5条SCoT引物4个箭菩豌豆种质的SCoT分析谱带数据。从所得的数据可以看出，5条SCoT引物可以把4个箭菩豌豆种质完全区分开，且通过对等位基因保留比例计算，发现随机取样10株时等位基因保留比例大于等于90%，一般来说保留比例大于85%可代表该种质大部分遗传信息。这说明各种质只需随机取样10株即可完成对种质纯度的鉴定。利用这一套科学、高效、便捷的箭菩豌豆纯度鉴别方法，可对箭菩豌豆种子的纯度进行评估和鉴别，起到保护牧草种质资源，防止假劣种质流入市场的作用，同时也为牧草新品种的选育及种质遗传多样性分析提供技术支持。[0123]图2.SCoT引物用于4个箭菩豌豆种质各种质随机取样10株时SCoT谱带分析聚类图[0124]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定引物，其特征在于引物为：2.—种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度鉴定试剂盒，其特征在于PCR扩增体3’；Scot35引物：5’-CATGGCTACCACCGGCCC-3’；Scot36引物：5’-GCAACAATGGCTACCACC-3’；Scot37引物：5’-ACGACATGGCGACCAGCG-3’；Scot38引物：5’-ACGACATGGCGACCACCG-3。3.—种采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：⑴箭菩豌豆种质DNA提取:随机取样，采用改进后的CTAB法提取待测种质基因组DNA备用；2采用SCoT引物对步骤⑴的箭菩豌豆种质DNA进行PCR扩增，其中PCR扩增反应的总体积是1〇μ1，扩增反应体系为：2XPowerTaqPCRMasterMix5.0yl，SCoT引物分别为1μI，包括Scot28引物：5’-CCATGGCTACCACCGCCA-3’为Ιμΐ;，,步骤⑴箭菩豌豆种质DNA50ngAU，2.Ομί，ddH202μ1;PCR扩增反应程序为94°C预变性4min;35个扩增循环:94°C变性Imin，退火lmin，72°C延伸2min;72°C延伸7min;4°C保存；3对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2-1.4%，凝胶组分为琼脂糖6·1-7·lg，ddH20450ml，10XTBE50ml，核酸染料9-12μ1;跑胶电压129-132V，电泳时间2hl5min-2h30min，关闭电源，用化学凝胶成像仪照相；⑷比较箭菩豌豆种质多态性位点的差异，确定箭菩豌豆品种纯度鉴定结果，箭菩豌豆种质平均多态性位点为21.4-27.4,通过统计0，1矩阵，统计等位基因数，计算观测杂合度，观测杂合度Ho=观察得到杂和个体数样本个体数总数，Ho均为100%，所统计位点均为多态性位点，等位基因保留比例大于85%可代表该种质大部分遗传信息，品种纯度为合格。4.如权利要求3所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，其特征在于步骤⑷还包括确定引物的等位基因数，按照对应待测品种的PCR扩增产物片段大小统计〇，1矩阵，得到相应等位基因数，根据统计的等位基因按计算公式计算多态信息含量PIC，其中：η为等位基因数目；Pi和Pj分别为第i和第j个等位基因的频率;在相同迀移位置上进行“0，Γ统计，构建箭菩豌豆种质的SCoT分析谱带数据，通过数据分析所用引物是否对箭菩豌豆种质进行完全区分。5.如权利要求3所述的采用SCoT分子标记简化箭菩豌豆品种纯度的鉴定方法，其特征在于还包括所述的每个箭菩豌豆种质最佳取样数为10个单株。

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