申请/专利权人：重庆医科大学

申请日：2020-07-24

公开（公告）日：2020-10-16

公开（公告）号：CN111778317A

主分类号：C12Q1/6827(20180101)

分类号：C12Q1/6827(20180101);C12Q1/6886(20180101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2024.02.02#发明专利申请公布后的视为撤回;2020.10.16#公开

摘要：调节分子探针与靶标之间的自由能差值是实现选择性识别DNA突变的可行方法。但是由于探针序列的变化程度有限，简单地通过改变探针的碱基组成来适度地利用热力学仍然是一个挑战。本专利通过在双链DNA探针中插入凸起环来调节对突变的识别能力。通过可控性调节探针与突变或野生型DNA进行链置换反应之前和反应之后的自由能变化，获得了比常规线性探针高得多的特异性。本专利设计的凸起环探针对突变碱基有较好的识别效果，当检测2飞摩尔靶标DNA时对突变的检测限可以达到0.02％。实验证实，该检测方法与液滴数字PCRddPCR有高度一致性，并且可以用于鉴定商业荧光PCR试剂盒或Sanger测序无法识别的肺组织样品中的低丰度L858R突变。上述结果表明，本专利在临床肺癌相关突变分析方面具有商业转化价值。

主权项：1.一种基于凸起环Bulge-loop链置换探针BLP的基因突变荧光检测方法及应用，具体操作包括以下方面：1、BLP的设计通过将Bulge-loopBL插入链置换探针中来调节对基因突变的鉴别能力。该方法依赖于在存在突变或野生型DNA的情况下，对链置换反应自由能变化的适度调节。以立足点为7个碱基的链置换探针为例，设计了BL结构长度为0-6nt，且定位于探针末端第7个碱基处的一系列探针，通过计算其对突变靶标的识别因子来确定BL结构长度设计参数。设计了BL结构分别定位于探针末端第7个碱基处和或定位于探针初始端第7个碱基处将立足点初始端作为探针初始端的四组探针，通过计算其对突变靶标的识别因子来确定BL结构位置设计参数。2、BLP的链置换反应分别设计了L858R、T790M、1676AG突变敏感的BLP。以EGFR基因L858R突变人工合成样本为例，将BLP，L858R突变靶标和野生型靶标分别溶解在PBS中。在200μL避光离心管中，在37℃条件下将40nM野生型靶标敏感的无荧光修饰竞争性阴影BLP和40nM突变靶标敏感的荧光BLP分别孵育40min，然后再等体积混合。将0.9μM的具有不同L858R突变丰度的样品分别添加到上述探针溶液中，同样用CaryEclipse荧光分光光度计检测溶液的荧光。3、不对称PCR富集单链检测靶标以EGFR基因L858R突变人工合成样本为例。一步法不对称PCR：在200μLPCR试管中，将25μLMaxDNAPolymerase2x，正向引物，反向引物，1fmol模板DNA和所需体积的灭菌水在冰上混合，总体积50μL。在Bio-Rad仪器上执行PCR程序98℃持续10s，60℃持续10s，72℃持续20s，40个循环。加入100μL,20nMBulge-loop探针，在65℃下孵育30min，然后进行荧光测量。两步法asyPCR：第一步，向200μLPCR试管中加入25μLMaxDNA聚合酶2x，2μL正向引物0.2μM，2μL反向引物0.2μM和1μL模板DNA1fmol，20μL灭菌超纯水在冰上混合。在Bio-Rad仪器上执行PCR程序98℃持续10s，60℃持续10s，72℃持续20s，40个循环。将25μLMaxDNA聚合酶2x，反向引物，1μLPCR产物和所需浓度的灭菌水混合至50μL的体积。PCR步骤和检测步骤按照与一步法不对称PCR相同的方式进行。4、PCR产物λexo切割法富集单链检测靶标以EGFR基因L858R突变人工合成样本为例。向200μLPCR试管中加入25μLMaxDNA聚合酶2x，正向引物1.2μM，5'-PO4反向引物1.2μM和1μL模板DNA1fmol，20μL灭菌超纯水在冰上混合。在Bio-Rad仪器上执行PCR程序98℃持续10s，60℃持续10s，72℃持续20s，40个循环。PCR扩增后，添加4μLλexo20U和6μLλexo反应缓冲液，在37℃下消化双链产物30min。75℃灭活10分钟，添加100μL步骤2中的BLP体系，65℃孵育30min。用荧光分光光度计检测荧光信号。5、BLP检测肺癌EGFR基因L858R突变的应用由于实验结果发现步骤3的不对称PCR富集突变靶标效果一般，临床样本检测采用步骤4的PCR产物λexo切割法富集单链检测靶标，然后用BLP检测。PCR反应步骤中第一轮变性温度为95度5min，第二轮开始与步骤4的PCR条件设置一致。肺癌基因组DNA样本作为PCR模版，用量为1μL。这样就建立起了基于荧光BLP探针的基因突变检测方法并将其应用于检测肺癌EGFR基因L858R突变。

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百度查询： 重庆医科大学 一种基于凸起环链置换探针的基因突变荧光检测方法及其应用

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