申请/专利权人：中国药科大学

申请日：2021-06-16

公开（公告）日：2024-03-29

公开（公告）号：CN113241131B

主分类号：G16C20/50

分类号：G16C20/50;G16B20/00;G01N33/68

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.29#授权;2021.08.27#实质审查的生效;2021.08.10#公开

摘要：本发明公开了一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD50预测方法，包括：使用能够表达GFP融合蛋白的DNA损伤响应荧光酵母传感器，通过对暴露于亚硝胺化合物后GFP融合蛋白表达水平进行实时监测，采用蛋白总表达水平TEL对遗传毒性进行定量，根据亚硝胺化合物的TEL1.5，对无TD50数据报道的亚硝胺化合物的TD50进行预测。本发明方法具有成本低、省时、信息可靠且样品用量少的优点，可以广泛应用，有利于提高药物研发速度与质量。

主权项：1.一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD50预测方法，其特征在于：包括：使用能够表达GFP融合蛋白的DNA损伤响应荧光酵母传感器，通过对暴露于亚硝胺化合物后GFP融合蛋白表达水平进行实时监测，采用蛋白总表达水平TEL对遗传毒性进行定量，根据亚硝胺化合物的TEL1.5，对无TD50数据报道的亚硝胺化合物的TD50进行预测；包括：步骤1、获取GFP荧光响应和OD600值：将DNA损伤响应荧光酵母传感器接种到培养基中，在转速160～240rpm、温度25～32℃下振荡培养，直至初始OD600值达到0.14～0.2；向黑色壁透明底微孔板加入酵母悬浮液孔，每孔再加入PBS缓冲液或与PBS等体积的待测亚硝胺化合物溶液，分别作为对照组和测试组，同时设置空白组：参照对照组，将每孔中酵母悬浮液替换为等体积的培养基；将96孔黑色透明底微孔板置于酶标仪中，振荡1min后，每隔3～6min在黑暗条件下测定GFP荧光响应和OD600值，在1.5～3h内持续测样；步骤2、蛋白总表达水平的计算：a、OD600和GFP原始数据校正：GFPi,t-校正＝GFPi,t-测试-GFPi,t-空白；ODi,t-校正＝ODi,t-测试-ODi,t-空白；其中，GFPi,t-测试表示在时间点t，测试组每种GFP融合蛋白i的荧光数据；GFPi,t-空白表示在时间点t，空白组每种GFP融合蛋白i的荧光数据；ODi,t-测试表示在时间点t，测试组每种GFP融合蛋白i的OD600数据；ODi,t-空白表示在时间点t，空白组每种GFP融合蛋白i的OD600数据；b、融合蛋白表达水平的计算：Pi,t＝GFPi,t-校正ODi,t-校正；其中，Pi,t表示在时间点t时GFP融合蛋白i的表达水平；c、融合蛋白表达诱导倍数的计算：FIi,t＝Pi,t-测试Pi,t-对照；其中，Pi,t-测试表示测试组在时间点t时GFP融合蛋白i的表达水平，Pi,t-对照是对照组在时间点t的GFP融合蛋白i的表达水平；FIi,t表示与对照组相比，在时间点t时GFP融合蛋白i的表达变化；d、融合蛋白表达总水平的计算： 其中，APi表示在暴露时间内，累积的GFP融合蛋白i的表达总水平；e、DNA损伤修复相关蛋白总表达水平的计算： 其中，n表示荧光酵母传感器集合中GFP融合蛋白数量；wi表示GFP融合蛋白i对应的损伤修复途径权重因子，所有权重因子赋值为1；TEL表示DNA损伤修复相关蛋白总表达水平，TEL反映了亚硝胺化合物的遗传毒性强度；步骤3、在GraphPadPrism软件中使用四参数对数非线性回归模型对亚硝胺化合物的浓度-TEL响应曲线进行拟合；根据拟合曲线计算TEL达到1.5时亚硝胺化合物的对应浓度TEL1.5；步骤4、在GraphPadPrism软件中对亚硝胺化合物的TEL1.5与TD50进行相关性分析；步骤5、按照步骤1-步骤4，使用DNA损伤响应荧光酵母传感器测定无TD50数据报道的亚硝胺化合物的GFP荧光响应和OD600值，根据计算得到的TEL1.5，对亚硝胺化合物的TD50进行预测。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国药科大学 一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD₅₀预测方法

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