申请/专利权人：苏州唐锟辰新能源科技有限公司

申请日：2017-12-30

公开（公告）日：2021-10-08

公开（公告）号：CN109991347B

主分类号：G01N30/88(20060101)

分类号：G01N30/88(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.12.09#未缴年费专利权终止;2019.08.02#实质审查的生效;2019.07.09#公开

摘要：本发明公开一种墨旱莲药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，涉及中药材的指纹图谱技术领域，该方法包括对照品溶液的制备、供试品的制备和高效液相色谱检测条件，取墨旱莲药材粉末精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85%乙醇50ml，加热回流1.5小时，放冷，摇匀，滤液蒸干,加水约50ml，加乙酸乙酯萃取3次,每次约50ml,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇定容至10ml,采用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；对供试品溶液进行高效液相色谱检测，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相为甲醇‑乙腈‑0.3%甲酸；进样量为5‑15μl；采用梯度洗脱方式，检测波长为340nm，流速为0.8mLmin，柱温为35℃，得到墨旱莲药材指纹图谱，本发明建立的墨旱莲药材指纹图谱可有效的监控墨旱莲药材的质量及鉴别其真伪。

主权项：1.一种墨旱莲药材的HPLC指纹图谱建立方法,其特征在于包括如下步骤：1）对照品溶液的制备：取蟛蜞菊内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含17μg的溶液，即得；2）供试品溶液的制备：选择不同产地7个样品，分别取过5号筛的粉末2-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85%乙醇50ml，加热回流1.5小时，放冷，摇匀，滤液蒸干,加水约50mL，加乙酸乙酯萃取3次,每次约50mL,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇定容至10mL,采用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；3）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μ1，注入液相色谱仪，测定，色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以乙腈为流动相B，以0.3%甲酸溶液为流动相C，进行梯度洗脱；流速:0.8mL·min-1;柱温:35℃;进样量:5-15μL；检测波长为340nm；理论板数按蟛蜞菊内酯峰计算应不低于4000；梯度洗脱程序为：时间分钟）流动相A%流动相B%流动相C%0510851515107535251560606015257570151580702010根据7批不同产地的药材HPLC指纹图谱结果,利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”生成药材共有模式的对照HPLC指纹图谱,得27个共有特征峰，依次标记，共有峰的相对保留时间为：0.120（峰1）、0.263（峰2）、0.367（峰3）、0.466（峰4）、0.500（峰5）、0.589（峰6）、0.706（峰7）、0.741（峰8）、0.783（峰9）、0.827（峰10）、0.840（峰11）、1（峰12，S）、1.052（峰13）、1.092（峰14）、1.120（峰15）、1.142（峰16）、1.300（峰17）、1.556（峰18）、1.593（峰19）、1.642（峰20）、1.670（峰21）、1.735（峰22）、1.860（峰23）、1.993（峰24）、2.072（峰25）、2.199（峰26）、2.250（峰27）。

全文数据：一种墨旱莲药材的HPLC指纹图谱建立方法技术领域本发明属于中药质量分析技术领域，具体涉及一种墨旱莲药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱方法进行墨旱莲药材的质量鉴别和控制。背景技术墨旱莲，系为菊科植物鳢肠的干燥地上部分，花开时采割，晒干。墨旱莲临床应用多为饮片，主治滋补肝肾，凉血止血。用于肝肾阴虚，牙齿松动，须发早白，眩晕耳鸣，腰膝酸软，阴虚血热吐血、衄血、尿血，血痢，崩漏下血，外伤出血。目前墨旱莲的质量控制方法采用的是单一物质的含量鉴别，但是墨旱莲因品种、产地的不同，其有效成分的含量存在一定的差异，仅凭单一成分的含量测定已明显不能满足于其质量控制，故用于临床的质量稳定性也难以保证。中药指纹图谱技术是符合中医理论及现状的较好的质量控制技术，因为它并不需要详细了解药物的具体活性成份信息，只需要了解个别指标性活性组分信息，以指标性成份峰作为标记，结合非指标成份进行比对，用来综合评价药物质量，既符合中医药理论的整体观点，也满足了对中药质量的可控、保证其疗效的要求。墨旱莲作为一种常用药，其质量控制的研究报道较少，本发明提出了一种墨旱莲药材的指纹图谱鉴别方法，能够从整体把握墨旱莲的质量情况，为墨旱莲的质量控制和真伪鉴别提供了一种有效的技术手段。发明内容本发明目的是为提供一种墨旱莲药材提取物的制备方法，并通过HPLC指纹图谱的方法对其进行质量鉴别和控制。包括如下步骤：1）对照品溶液的制备：取蟛蜞菊内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含17μg的溶液，即得。2）供试品溶液的制备：选择不同产地7个样品，分别取粉末（过5号筛）约2-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85%乙醇50ml，加热回流1.5小时，放冷，摇匀，滤液蒸干,加水约50ml，加乙酸乙酯萃取3次,每次约50ml,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇定容至10ml,采用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。3）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以乙腈为流动相B，以0.3%甲酸溶液为流动相C，进行梯度洗脱；流速:0.8mL·min-1;柱温:35℃;进样量:5-15μl；检测波长为340nm。理论板数按蟛蜞菊内酯峰计算应不低于4000。梯度洗脱程序为：时间分钟）流动相A%流动相B%流动相C%0510851515107535251560606015257570151580702010根据7批不同产地的药材HPLC指纹图谱结果,利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”生成药材共有模式的对照HPLC指纹图谱,得27个共有特征峰，依次标记，共有峰的相对保留时间为：0.120（峰1）、0.263（峰2）、0.367（峰3）、0.466（峰4）、0.500（峰5）、0.589（峰6）、0.706（峰7）、0.741（峰8）、0.783（峰9）、0.827（峰10）、0.840（峰11）、1（峰12，S）、1.052（峰13）、1.092（峰14）、1.120（峰15）、1.142（峰16）、1.300（峰17）、1.556（峰18）、1.593（峰19）、1.642（峰20）、1.670（峰21）、1.735（峰22）、1.860（峰23）、1.993（峰24）、2.072（峰25）、2.199（峰26）、2.250（峰27）。附图说明图1墨旱莲药材的HPLC指纹图谱。具体实施方式1．对照品溶液的制备取蟛蜞菊内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含17μg的溶液，即得。2.供试品溶液的制备选择不同产地7个样品，分别取粉末（过5号筛）约2-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85%乙醇50ml，加热回流1.5小时，放冷，摇匀，滤液蒸干,加水约50ml，加乙酸乙酯萃取3次,每次约50ml,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇定容至10ml,采用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。3.仪器与材料Agilent1260高效液相色谱仪，二元泵，紫外检测器，柱温箱，自动进样器，真空脱气机，美国Agilent公司产品，处理软件：Agilent化学工作站。色谱条件：色谱柱：AgilentC18色谱柱（250mm×4.6mm）；真空干燥箱；墨旱莲药材，甲醇、乙腈（色谱纯），乙醇、甲酸、乙酸乙酯（分析纯）。4.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相色谱仪，测定，仪器色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以乙腈为流动相B，以0.3%甲酸溶液为流动相C，进行梯度洗脱；流速:0.8mL·min-1;柱温:35℃;进样量:10μl；检测波长为340nm。理论板数按蟛蜞菊内酯峰计算应不低于4000。梯度洗脱程序为：时间分钟）流动相A%流动相B%流动相C%0510851515107535251560606015257570151580702010根据7批不同产地的药材HPLC指纹图谱结果,利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软7件”生成药材共有模式的对照HPLC指纹图谱，见图1,得27个共有特征峰，依次标记，共有峰的相对保留时间为：0.120（峰1）、0.263（峰2）、0.367（峰3）、0.466（峰4）、0.500（峰5）、0.589（峰6）、0.706（峰7）、0.741（峰8）、0.783（峰9）、0.827（峰10）、0.840（峰11）、1（峰12，S）、1.052（峰13）、1.092（峰14）、1.120（峰15）、1.142（峰16）、1.300（峰17）、1.556（峰18）、1.593（峰19）、1.642（峰20）、1.670（峰21）、1.735（峰22）、1.860（峰23）、1.993（峰24）、2.072（峰25）、2.199（峰26）、2.250（峰27）。5．色谱条件的选择5.1检测波长的选择为了获取多层次的信息,需要选择数个不同的检测波长,在实验中采用了二极管阵列检测器做全波长检扫描,分别提取在285、300、320、340、350、375nm波长处的色谱图,结果在340nm处各色谱峰均有较好的紫外吸收,色谱信息丰富,且基线较平。5.2柱温及流速的选择在实验中分别考察了柱温为20、25、30、35℃的色谱图,在柱温为35℃时,各峰的分离度较好,故选择柱温为35℃。实验中分别考察了0.8mLmin、1.0mLmin、1.2mLmin不同流速下的色谱,结果表明以0.8mLmin为流速各色谱峰分离度较好,保留时间适中。5.3色谱条件的选择实验过程中使用了多种流动相系统:甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-乙腈-0.3%甲酸等流动相系统梯度洗脱,并对梯度洗脱程序进行优化,结果表明以甲醇-乙腈-0.3%甲酸系统,实验所确定的梯度程序使各色谱峰达到基线分离,峰形对称,分离较好,保留时间适中。5.4提取溶剂的选择对不同浓度的提取溶剂甲醇、乙醇、提取方法超声、冷浸、回流进行了考察,结果表明85%乙醇回流提取峰分离度较好,达到基线分离,效果最好。因此,选择85%乙醇回流提取。5.5空白试验为考察流动相中是否有杂质干扰样品分析,吸取甲醇-乙腈-0.3%甲酸10μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图,实验溶剂基本无峰,对检测无干扰。5.6本实验参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》,将样品图谱中的相对保留时间和相对峰面积比的RSD作为考察仪器和方法的精密度、稳定性和重复性的指标,使用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A版软件计算指纹图谱的相似度,使用简单,可快速、准确的应用于墨旱莲药材指纹图谱的相似度分析研究中。本实验建立的墨旱莲药材纹图谱的特征共有色谱峰,能够为墨旱莲药材药材的鉴别和质量控制提供可靠的科学依据。收集的不同地区的批药材样品,有一定的广泛性与同一性。

权利要求：1.一种墨旱莲药材的HPLC指纹图谱建立方法,其特征在于包括如下步骤：1）对照品溶液的制备：取蟛蜞菊内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含17μg的溶液，即得；2）供试品溶液的制备：选择不同产地7个样品，分别取粉末（过5号筛）约2-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85%乙醇50ml，加热回流1.5小时，放冷，摇匀，滤液蒸干,加水约50ml，加乙酸乙酯萃取3次,每次约50ml,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇定容至10ml,采用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；3）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以乙腈为流动相B，以0.3%甲酸溶液为流动相C，进行梯度洗脱；流速:0.8mL·min-1;柱温:35℃;进样量:5-15μl；检测波长为340nm；理论板数按蟛蜞菊内酯峰计算应不低于4000；梯度洗脱程序为：根据7批不同产地的药材HPLC指纹图谱结果,利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”生成药材共有模式的对照HPLC指纹图谱,得27个共有特征峰，依次标记，共有峰的相对保留时间为：0.120（峰1）、0.263（峰2）、0.367（峰3）、0.466（峰4）、0.500（峰5）、0.589（峰6）、0.706（峰7）、0.741（峰8）、0.783（峰9）、0.827（峰10）、0.840（峰11）、1（峰12，S）、1.052（峰13）、1.092（峰14）、1.120（峰15）、1.142（峰16）、1.300（峰17）、1.556（峰18）、1.593（峰19）、1.642（峰20）、1.670（峰21）、1.735（峰22）、1.860（峰23）、1.993（峰24）、2.072（峰25）、2.199（峰26）、2.250（峰27）。

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