申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2023-12-06

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN117737125A

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N7/01;A61K39/255;A61P31/22;C12R1/93

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.09#实质审查的生效;2024.03.22#公开

摘要：本发明公开了一种鸭瘟病毒gE区域缺失株及其构建方法和应用，该方法包含：1获得打靶片段：以pEP‑Kan‑S质粒作模板，针对缺失株设计的引物扩增获得打靶片段；2第一次同源重组缺失目的基因；3第二次同源重组删除Kan基因，获得鸭瘟病毒gE区域缺失株DPV‑CHv‑gEΔ200‑361或DPV‑CHv‑gEΔ397‑419感染性克隆；4将鸭瘟病毒gE区域缺失株DPV‑CHv‑gEΔ200‑361或DPV‑CHv‑gEΔ397‑419感染性克隆转染鸭源细胞，获得鸭瘟病毒gE区域缺失病毒DPV‑CHv‑gEΔ200‑361或DPV‑CHv‑gEΔ397‑419。本发明构建的缺失株DPV‑CHv‑gEΔ200‑361或DPV‑CHv‑gEΔ397‑419的毒力降低，在体内外均具有良好的遗传稳定性，免疫鸭能产生较好的抗体水平，能抵抗鸭瘟强毒攻击，并能清除鸭体内感染的强毒，具有作为弱毒疫苗的潜力。

主权项：1.一种鸭瘟病毒gE区域缺失株感染性克隆的构建方法，其特征在于，该构建方法用于构建鸭瘟病毒gE区域缺失株DPV-CHv-gEΔ200-361或DPV-CHv-gEΔ397-419感染性克隆，该方法包含：1获得打靶片段以pEP-Kan-S质粒作为模板，针对缺失株DPV-CHv-gEΔ200-361用核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物PCR扩增获得gEΔ200-361打靶片段，针对缺失株DPV-CHv-gEΔ397-419用核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物PCR扩增获得gEΔ397-419打靶片段；2第一次同源重组缺失目的基因在感受态菌中加入gEΔ200-361或gEΔ397-419打靶片段混匀，2.5kv电击；加入LB液体培养基混匀，30℃、220rmin培养；离心去除上清液，加入液体LB吹散混匀后转移到含Cm和Kan的LB平板上均匀涂布，30℃培养；挑取若干个单菌落在含Cm和Kan的LB平板上划线，30℃培养；取单菌落作模板，用核苷酸序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的引物，PCR鉴定鸭瘟病毒gE区域缺失菌；3第二次同源重组删除Kan基因挑取步骤2鉴定的阳性菌落接种至含Cm液体LB中，30℃、180rmin培养过夜作种子液；取种子液加入含Cm的液体LB中，30℃、180rmin培养；加入含Cm的液体LB和L-阿拉伯糖，30℃、220rmin培养；于42℃、180rmin培养，再30℃、180rmin培养；取菌液加入液体LB混匀后均匀涂布在含Cm抗性的LB平板上，30℃培养；挑取若干单菌落分别对应地划线在含Cm+Kan的LB平板上和含Cm的LB平板上，30℃培养；选择Cm+KanLB平板上不长而CmLB平板上生长的菌落进行PCR鉴定，采用核苷酸序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的引物，鉴定成功的菌落为鸭瘟病毒gE区域缺失株DPV-CHv-gEΔ200-361或DPV-CHv-gEΔ397-419感染性克隆。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 四川农业大学 一种鸭瘟病毒gE区域缺失株及其构建方法和应用

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