申请/专利权人：上海龙殷生物科技有限公司;波顿(上海)生物技术有限公司

申请日：2022-03-25

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN114736942B

主分类号：C12P19/44

分类号：C12P19/44;C12P19/18;C12P19/24;C12P19/02;C07H15/04;C07H1/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2022.07.29#实质审查的生效;2022.07.12#公开

摘要：本发明公开了一种α‑甘油葡萄糖苷的制备方法，提供一种生产甘油葡萄糖苷方法，在所提供的生产甘油葡萄糖苷方法中，以蔗糖和甘油作为直接底物，通过蔗糖磷酸合成酶催化糖基转移反应获得α‑甘油葡萄糖苷与果糖，然后通过进一步添加D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶催化果糖的异构化反应，使得产物中的果糖进一步形成阿洛酮糖。本发明的方法大幅降低了反应产物中的果糖含量。相对于甘油葡萄糖苷制备形成的高果糖产物，阿洛酮糖与甘油葡萄糖苷的色谱分离度要远远高于果糖与甘油葡萄糖苷的分离度，因此大幅降低了产物后处理的难度，从而大幅降低了产物中与甘油葡萄苷分难度及分离成本。

主权项：1.一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1、以蔗糖和甘油为原料，使用蔗糖磷酸酶催化获得主要为α-甘油葡萄糖苷与果糖的中间产物一；步骤2、以步骤1中的中间产物一为基础，使用阿洛酮糖差向异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖获得中间产物二；步骤3、以步骤2中的中间产物二为基础，将α-甘油葡萄糖糖苷分离与提纯；还包含将阿洛酮糖分离回收的步骤；所述蔗糖磷酸酶通过原核表达系统一表达获得，所述蔗糖磷酸酶目的基因序列如SEQIDNO.1所示；所述原核表达系统一表达收集获得的菌体作为蔗糖磷酸酶粗酶；所述步骤1中的初始反应配方按质量比为：水100份、蔗糖250份、蔗糖磷酸酶粗酶25份、pH7.0的PB磷酸缓冲液（0.2molL）50份、甘油100份、0.25份的Tween80；所述反应条件为：35℃搅拌反应24h，向反应体系内补加10份LPP粗酶，50份甘油，50份水和50份蔗糖，继续反应24h；所述阿洛酮糖差向异构酶通过原核表达系统二表达获得，所述阿洛酮糖差向异构酶目的基因序列如SEQIDNO.2所示；所述原核表达系统二表达收集获得的菌体作为阿洛酮糖差向异构酶，所述步骤2为：阿洛酮糖差向异构酶30份，硼砂118份，之后调整反应温度至55℃，搅拌反应60h，之后使用50%硫酸将反应体系酸至pH3.0终止反应；所述步骤3具体包括：（1）酸化所述的中间产物二，然后利用离心或过滤去除中间产物二中的菌体、酶及沉淀的蛋白等固态杂质；（2）使用活性炭对去除固态杂质的中间产物二进行脱色，之后采用离心或过滤去除活性炭；（3）通过层析分离α-甘油葡萄糖苷：采用活性炭层析柱进行分离，先以脱色后的中间产物二进行上样吸附，然后以纯水洗脱各糖，至流出液中无检出后，采用6%ww的乙醇水溶液进行α-甘油葡萄糖苷的分段洗脱，最后合并α-甘油葡萄糖苷纯度高于99%（色谱纯）的洗脱液分段；（4）对步骤（3）合并的含α-甘油葡萄糖苷的洗脱液在真空浓缩釜内60℃减压浓缩，至α-甘油葡萄糖苷含量约50%ww，采用冷冻干燥法干燥获得纯度99%的α-甘油葡萄糖苷。

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