申请/专利权人：广东一方制药有限公司

申请日：2018-12-21

公开（公告）日：2022-05-03

公开（公告）号：CN109828040B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/36

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.05.03#授权;2019.06.25#实质审查的生效;2019.05.31#公开

摘要：本发明涉及一种墨旱莲药材UPLC特征图谱构建方法和检测方法。该特征图谱构建方法包括以下步骤：分别以蟛蜞菊内酯和4,5‑二‑O‑咖啡酰奎宁酸为对照品制备对照品参照物溶液；以墨旱莲对照药材制备对照药材参照物溶液；分别取墨旱莲药材和标准汤剂样品，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液和标准汤剂供试品溶液；分别吸取所述参照物溶液、供试品溶液、标准汤剂供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定；比较所得供试品图谱与标准汤剂供试品图谱，标定8个水溶性成分的特征峰，获得墨旱莲药材的UPLC特征图谱。该特征图谱能用于定性、定量分析墨旱莲药材的质量，能够确保采用该药材制备的墨旱莲传统汤剂的质量，也适用于检测含墨旱莲的其它制剂。

主权项：1.一种墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：参照物溶液的制备：分别以蟛蜞菊内酯和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向墨旱莲对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；供试品溶液的制备：向墨旱莲药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液I，将所述提取液I滤过，取续滤液作为供试品溶液I；向墨旱莲标准汤剂样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液II，将所述提取液II滤过，取续滤液作为供试品溶液II；测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、供试品溶液I和供试品溶液II注入超高效液相色谱仪中测定，标定水溶性共有峰，即得墨旱莲药材UPLC特征图谱；所述超高效液相色谱的色谱条件包括：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三乙胺磷酸缓冲液，所述三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.5％-0.6％的磷酸和体积分数为0.7％-0.83％的三乙胺，梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0-3min，流动相A由体积分数为11％升高到16％，流动相B由体积分数为89％降低到84％；3min-9min，保持流动相A体积分数为16％，保持流动相B体积分数为84％；9min-20min，流动相A由体积分数为16％升高到20％，流动相B由体积分数为84％降低到80％；20min-34min，保持流动相A体积分数为20％，保持流动相B体积分数为80％；34min-40min，流动相A由体积分数为20％升高到80％，流动相B由体积分数为80％降低到20％；40min-41min，流动相A由体积分数为80％降低到11％，流动相B由体积分数为20％升高到89％；41min-50min，流动相A保持体积分数为11％，流动相B保持体积分数为89％；所述提取溶剂为体积分数为60％-80％的乙醇水溶液，用量为每1g墨旱莲药材加入50mL-100mL。

全文数据：墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法技术领域本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法。背景技术墨旱莲别称旱莲草、金陵草、乌心草、白花蟛蜞菊等。以原名鳢肠，始载于《唐本草》，为菊科植物鳢肠EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，是常用中药之一，具有滋补肝肾，凉血止血的功效。用于肝肾阴虚，牙齿松动，须发早白，眩晕耳鸣，腰膝酸软，阴虚血热吐血、衄血、尿血，血痢，崩漏下血，外伤出血。近代药理学研究表明墨旱莲有免疫调节、抗衰老、保肝、抗肿瘤等活性作用。墨旱莲所含的化学成分有三萜皂苷类、噻吩类、香豆草醚类、黄酮类等。其具有较强的临床应用价值，市场需求广阔，被开发成中药配方颗粒及相关复方制剂广泛用于临床。中药的临床使用多以传统汤剂为主。中药汤剂的物质基础，是中医理论指导下防治疾病的基础。现行的法定标准仅针对单一成分进行定量控制，量效关系不能全面反映中药成分的整体作用。在现阶段，中药绝大多数有效成分未明确的情况下，中药指纹图谱特征图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。《中国药典》2015年版将蟛蜞菊内酯作为墨旱莲质量评价指标，仅对蟛蜞菊内酯含量进行控制，并不能全面反映其质量。且目前文献研究报道的关于墨旱莲特征图谱的建立，均只针对药材原料，指标成分多以脂溶性成分为研究对象，主要用于中药材真伪、产地、品质差异的定性鉴别，较难全面反映墨旱莲的质量特征，也不能反应传统中药汤剂的物质基础特征。发明内容基于此，本发明提供一种墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法。构建的墨旱莲药材的特征图谱具有8个水溶性成分的特征峰，可以快速、全面实现对墨旱莲药材多个特征成分的质量监控，并能反应墨旱莲的传统中药汤剂的物质基础特征。具体技术方案为：一种墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：参照物溶液的制备：分别以蟛蜞菊内酯和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向墨旱莲对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；供试品溶液的制备：向墨旱莲药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液I，将所述提取液I滤过，取续滤液作为供试品溶液I；向墨旱莲标准汤剂样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液II，将所述提取液II滤过，取续滤液作为供试品溶液II；测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、供试品溶液I和供试品溶液II注入超高效液相色谱仪中测定，标定水溶性共有峰，即得墨旱莲药材UPLC特征图谱。在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三乙胺磷酸缓冲液，所述三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.5％-0.6％的磷酸和体积分数为0.7％-0.83％的三乙胺，梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0-3min，流动相A由体积分数为11％升高到16％，流动相B由体积分数为89％降低到84％；3min-9min，保持流动相A体积分数为16％，保持流动相B体积分数为84％；9min-20min，流动相A由体积分数为16％升高到20％，流动相B由体积分数为84％降低到80％；20min-34min，保持流动相A体积分数为20％，保持流动相B体积分数为80％；34min-40min，流动相A由体积分数为20％升高到80％，流动相B由体积分数为80％降低到20％；40min-41min，流动相A由体积分数为80％降低到11％，流动相B由体积分数为20％升高到89％；41min-50min，流动相A保持体积分数为11％，流动相B保持体积分数为89％。在其中一个实施例中，所述色谱柱为AgilentZORBAXSBC18。在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：柱温28℃-32℃，流速为每分钟0.28mL-0.32mL，检测波长为254nm-360nm。在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件为：安捷伦ZORBAXSBC18色谱柱2.1×100mm，1.8μm；流动相A为乙腈，流动相B为三乙胺磷酸缓冲液，所述三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.53％的磷酸和体积分数为0.77％-0.83％的三乙胺，梯度洗脱，流速：0.3mlmin；柱温为30℃；检测波长：330nm。理论板数按蟛蜞菊内酯峰计算应不低于8000。在其中一个实施例中，所述提取溶剂为体积分数为60％-80％的甲醇水溶液，用量为每1g墨旱莲药材加入50mL-100mL。在其中一个实施例中，所述加热回流的时间为60min-90min。本发明还提供墨旱莲药材的检测方法。具体技术方案为：一种墨旱莲药材的检测方法，包括以下步骤：参照物溶液的制备：分别以蟛蜞菊内酯和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向墨旱莲对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；待测样品溶液的制备：向待测样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液III，将所述提取液III滤过，取续滤液作为待测样品溶液；测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中测定，即可。在其中一个实施例中，供试品溶液的制备中，所述墨旱莲药材包含有不同产地的墨旱莲药材，本发明的供试品原料来自全国墨旱莲产量较大的6个道地或主要产区，共18批次样品，具有充分的代表性。在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三乙胺磷酸缓冲液，所述三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.5％-0.6％的磷酸和体积分数为0.7％-0.83％的三乙胺，梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0-3min，流动相A由体积分数为11％升高到16％，流动相B由体积分数为89％降低到84％；3min-9min，保持流动相A体积分数为16％，保持流动相B体积分数为84％；9min-20min，流动相A由体积分数为16％升高到20％，流动相B由体积分数为84％降低到80％；20min-34min，保持流动相A体积分数为20％，保持流动相B体积分数为80％；34min-40min，流动相A由体积分数为20％升高到80％，流动相B由体积分数为80％降低到20％；40min-41min，流动相A由体积分数为80％降低到11％，流动相B由体积分数为20％升高到89％；41min-50min，流动相A保持体积分数为11％，流动相B保持体积分数为89％。在其中一个实施例中，所述色谱柱为AgilentZORBAXSBC18。在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：柱温28℃-32℃，流速为每分钟0.28mL-0.32mL，检测波长为254nm-360nm。在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件为：安捷伦ZORBAXSBC18色谱柱2.1×100mm，1.8μm；流动相A为乙腈，流动相B为三乙胺磷酸缓冲液，所述三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.53％的磷酸和体积分数为0.77％-0.83％的三乙胺，梯度洗脱，流速：0.3mlmin；柱温为30℃；检测波长：330nm。理论板数按蟛蜞菊内酯峰计算应不低于8000。在其中一个实施例中，所述提取溶剂为体积分数为60％-80％的甲醇水溶液，用量为每1g墨旱莲药材加入50mL-100mL。在其中一个实施例中，所述加热回流的时间为60min-90min。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用超高效液相色谱UPLC法构建墨旱莲药材的特征图谱。引入墨旱莲标准汤剂的特征图谱进行研究，针对墨旱莲标准汤剂与墨旱莲药材共有的水溶性成分特征成分进行研究标记了8个共有特征峰，并采用UPLC-MS和相关对照品确认了5个共有特征峰的成分，分别为咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和蟛蜞菊内酯并作为墨旱莲药材特征图谱特征峰确定的依据，能够很好的表征药材原料到汤剂的物质传递，不仅能够很好的把控药材质量，而且也能够确保汤剂的质量；同时，采用了对照品、对照药材双重对照，可以有效克服液相条件指纹图谱固有存在的耐用性偏差问题，比较更加全面。本发明以含量测定峰蟛蜞菊内酯作为参照峰，规定其他7个特征峰的相对保留时间和相对峰面积限量范围，实现多个特征成分的定量化，符合中药的整体作用理念。本发明采用了UPLC法，与常规HPLC法相比，更加高效、快速、环保；采用本发明构建的特征图谱及方法，重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对墨旱莲药材多个特征成分的质量监控，既提升了墨旱莲药材的质量控制水平，又提升和稳定墨旱莲药材的内在质量，为临床提供符合墨旱莲标准汤剂要求的原料，为墨旱莲相关的制剂工艺生产过程提供重要的多指标参数依据。附图说明图1为不同流动相系统下墨旱莲药材特征图谱；图2为不同洗脱方法下墨旱莲药材特征图谱；图3为不同流动相缓冲液下墨旱莲药材特征图谱；图4为不同波长下墨旱莲药材特征图谱；图5为完整性考察特征图谱；图6为18批墨旱莲药材特征图谱的叠加图峰1:咖啡酸；峰2:木犀草苷；峰3：异绿原酸B；峰5：4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；峰8s：蟛蜞菊内酯；图7为18批墨旱莲标准汤剂特征图谱的叠加图；图8为墨旱莲标准汤剂特征图谱；图9为墨旱莲标药材、墨旱莲标准汤剂对照特征图谱；图10为专属性考察特征图谱；图11为墨旱莲药材对照特征图谱；图12为待测样品特征图谱。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明的墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建1、仪器与试剂沃特世液相色谱仪型号：H-Class；检测器：PDA；厂家：沃特世仪器公司；AgilentZORBAXSBC18色谱柱2.1×100mm，1.8μm色谱柱编号：037、025，040；万分之一天平ME204E，梅特勒-托利多仪器有限公司，百万分之一天平型号：XP26，厂家：梅特勒-托利多仪器有限公司；电热恒温水浴锅型号：HWS28型；厂家：上海一恒科技有限公司；数控超声波清洗器型号：KQ-500DE；厂家：昆山市超声仪器有限公司；超纯水系统型号：Milli-Q-Direc；厂家：默克股份有限公司。甲醇、乙醇为分析纯天津富宇精细化工有限公司，液相用甲醇、乙腈为色谱纯默克股份有限公司，三乙胺、磷酸为色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司，水为超纯水取自实验室Milli-Q超纯水系统，默克股份有限公司。2、试药蟛蜞菊内酯对照品批号：111885-201403，含量以99.6％计，中国食品药品检定研究院；4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品批号：111894-201102，含量以94.10％计，中国食品药品检定研究院；墨旱莲药材18批墨旱莲药材信息见表2-2。药材来源：本研究共收集了共18批墨旱莲原药材，如表1所示，其中来自广东省3批，山东省3批，江苏省6批，安徽省3批，河南省2批，广西省1批。详细来源：略。表1备注：蟛蜞菊内酯含量是按中国药典2015版墨旱莲项下含量测定方法测定。3、参照物溶液的制备1对照品参照物溶液的制备：取蟛蜞菊内酯对照品3.868mg，置10ml容量瓶中，加甲醇制成每1ml含蟛蜞菊内酯385.2528μg的溶液，即得母液，吸取上述母液200μl，置10ml容量瓶中，加70％乙醇制成每1ml分别含蟛蜞菊内酯7.7051μg的溶液，即得蟛蜞菊内酯对照品参照物溶液。取4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品2.143mg，置10ml容量瓶中，加70％体积分数乙醇水溶液制成每1ml含蟛蜞菊内酯201.6563μg的溶液，即得。上述母液各吸取200μl置10ml容量瓶中，加70％体积分数乙醇水溶液制成每1ml分别含蟛蜞菊内酯7.7051μg，4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸4.0331ug的溶液，即得4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品参照物溶液。2对照药材参照物溶液：取墨旱莲对照药材粉末过三号筛1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％体积分数乙醇水溶液50ml，称定重量，加热回流1h，取提取液，将所述提取液放冷，用70％体积分数乙醇水溶液补足减失的重量，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。3标准汤剂的制备：取墨旱莲饮片100g，加水煎煮二次，第一次煎煮加14倍量水，浸泡30分钟，武火煮沸后改文火再煎煮60分钟，用350目筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；第二次煎煮加11倍量水，武火煮沸后改文火再煎煮40分钟，用350目筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；合并两次滤液，减压浓缩至清膏含固率约为12％后，分装至西林瓶中，每瓶分装2ml，真空冷冻干燥，取出，轧铝盖即得。4、供试品溶液的制备1供试品溶液的制备：取墨旱莲药材粉末过三号筛0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％体积分数乙醇水溶液50ml，称定重量，加热回流1h，取提取液，将所述提取液放冷，用70％体积分数乙醇水溶液补足减失的重量，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。2标准汤剂供试品溶液的制备取墨旱莲标准汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％体积分数乙醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，用70％体积分数乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。5、色谱条件的确定2流动相系统选择考察4种不同流动相系统，甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2％体积分数磷酸水溶液、乙腈-0.2％体积分数磷酸水溶液，选择最优的流动相系统作为墨旱莲特征图谱的流动相系统。色谱条件：AgilentSBC182.1mm×100mm，1.8μm；柱温：30℃；进样量：1μl；检测波长：330nm；以乙腈甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水为流动相B，梯度条件：0～30min：5％→95％；流速为0.3mlmin。结果见图1。通过比较甲醇-水、甲醇-酸、乙腈-水、乙腈-酸系统的图谱，发现乙腈-酸水系统图谱色谱峰信息比较丰富，峰型尖锐、对称，故采用乙腈-酸水系统。3洗脱梯度方法考察比较了表2-5中的4种洗脱梯度方法，选取最优的作为墨旱莲特征图谱洗脱方法。色谱条件：AgilentSBC182.1mm×100mm，1.8μm；柱温：30℃；进样量：1μl；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表2～5中规定的梯度进行洗脱，流速为0.3mlmin。结果见图2。表2表3表4表5对比了4种洗脱梯度，其中方法4的分离效果及峰型较好，且分析时间较短，故采用方法4作为最终洗脱梯度。4流动相考察本次实验选取0.2％体积分数醋酸水溶液、0.2％体积分数甲酸水溶液、0.2％体积分数磷酸水溶液、三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.53％的磷酸和体积分数为0.8％三乙胺，PH2.4，4种流动相进行比较，确定合适的流动相。色谱条件：AgilentSBC182.1mm×100mm，1.8μm；柱温：30℃；进样量：1μl；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，分别以0.2％磷酸、0.2％醋酸、0.2％甲酸、三乙胺磷酸缓冲液为流动相B，按表5中规定的梯度进行洗脱，流速为0.3mlmin。结果见图3。比较4种不同流动相酸度，不同流动相酸度对峰型和出峰时间影响较大，三乙胺磷酸缓冲液PH2.4系统效果较好，各色谱峰的分离效果和峰型达到要求，最终确定三乙胺磷酸缓冲液PH＝2.4作为流动相。5最佳吸收波长的确定通过查阅文献可知，墨旱莲特征图谱的测定波长主要有270nm、330nm。在此二种波长的基础上，结合254nm、300nm、360nm进行比较，确定最佳吸收波长。色谱条件：AgilentSBC182.1mm×100mm，1.8μm；柱温：30℃；进样量：1μl；检测波长：254nm、270nm、300nm、330nm、360nm；以乙腈为流动相A，三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.53％的磷酸和体积分数为0.8％三乙胺，PH2.4为流动相B，按表5中规定的梯度进行洗脱，流速为0.3mlmin。结果见图4。实验结果：比较几个不同通道，发现330nm的峰信息较全，各主要峰吸收强，故选择330nm作为检测波长。6完整性分析对上述色谱条件进行完整性分析，考察样品是否完全洗脱。色谱条件：AgilentSBC182.1mm×100mm，1.8μm；柱温：30℃；进样量：1μl；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，以三乙胺磷酸缓冲液PH2.4为流动相B，按表5中规定的梯度进行洗脱，流速为0.3mlmin。结果见图5。实验结果表明：45分钟后无明显色谱峰，该色谱条件能将墨旱莲中大部分的成分分离出来，不会影响下一针。7色谱条件的确定色谱条件：AgilentSBC182.1×100mm，1.8μm；柱温：30℃；进样量：1μl；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，以三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.53％的磷酸和体积分数为0.8％三乙胺，PH2.4为流动相B，梯度条件如表5；流速为0.3mlmin。6、供试品溶液制备方法考察对墨旱莲药材供试品溶液制备方法的提取溶剂、提取方式、溶剂用量、提取时间进行考察，确定供试品溶液制备方法1提取溶剂考察本次实验分别考察了不同提取溶剂对墨旱莲药材特征图谱的影响，选取甲醇、70％体积分数甲醇水溶液、乙醇、70％体积分数乙醇水溶液、稀乙醇作为提取溶剂，对不同提取溶剂的样品溶液特征图谱进行测定，确定最佳提取溶剂。供试品溶液的制备：取墨旱莲药材批号：G17051591.0g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、乙醇、70％乙醇、稀乙醇50ml，称定重量，加热回流1h，将提取液取出放冷，再称定重量，分别用对应溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，即得。按57色谱条件进行进样分析，墨旱莲药材特征图谱不同提取溶剂考察结果见表6。表6通过对比5种不同提取溶剂的色谱图可发现，5种提取溶剂色谱图的色谱峰数目与色谱峰峰形一致，总峰面积大小的顺序为：稀乙醇70％乙醇70％甲醇乙醇甲醇；综合考虑各溶剂的提取能力、色谱峰峰形、峰面积称样量的值、溶剂效应和毒性大小等，最终采用70％体积分数乙醇水溶液作为提取溶剂。2提取方式考察本次实验考察不同提取方式对墨旱莲药材特征图谱的影响，选取回流提取与超声提取两种方式。对不同提取方式的样品溶液特征图谱进行测定，确定最佳提取方式。供试品的制备：取墨旱莲标药材批号：G17051591.0g，平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇50ml，称定重量，分别采用回流提取1h、超声250W，40KHz1h，分别将提取液放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按57的色谱条件进行进样分析。墨旱莲药材特征图谱不同提取方式考察结果见表7。表7对比了两种提取方式，不同提取方式的色谱图色谱峰数目与色谱峰峰形一致，峰面积加和称样量的顺序为：回流超声，故选择回流作为处理方式。3溶剂用量考察本次实验考察不同溶剂用量对墨旱莲药材特征图谱的影响，选取溶剂用量为15ml、25ml、50ml、100ml。取墨旱莲药材粉末过三号筛批号：G17051591.0g，平行4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇15ml、25ml、50ml、100ml，称定重量，加热回流提取1小时，将提取液放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按57色谱条件进行进样分析。墨旱莲药材特征图谱不同溶剂用量考察结果见表8。表8实验结果：对比了不同溶剂用量对墨旱莲药材特征图谱的影响，其总峰面积大小的顺序位50ml100ml25ml15ml，100ml的主要峰响应度较小，从“峰面积加和×稀释倍数称样量”结果和节省溶剂方面考虑，结合节省溶剂考虑，溶剂用量选用50ml。4提取时间考察本次实验考察不同提取时间对墨旱莲药材特征图谱的影响，选取超声提取时间分别为：15min、30min、60min、90min。对不同提取时间的样品溶液特征图谱进行测定，确定最佳提取时间。供试品的制备：取墨旱莲标药材批号：G1705159约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇50ml，称定重量，分别采用回流提取15min、30min、60min、90min，将提取液放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按57的色谱条件进行进样分析。墨旱莲药材特征图谱不同提取方式考察结果见表9。表9通过对比不同回流时间的墨旱莲药材特征图谱，可发现随着回流时间的增加，色谱图总峰面积略有增加，回流60min与90min峰面积差异不明显，说明回流60min已经把墨旱莲的主要成分基本提取完全，为方便实验选取回流时间为60min。5供试品溶液的制备方法确定通过对不同提取溶剂、溶剂用量、不同提取方式及不同提取时间进行考察，确定供试品的制备方法为：取墨旱莲药材粉末过三号筛1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，加热回流1小时，将提取液放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。7、墨旱莲药材特征图谱共有峰的确定取18批墨旱莲药材，按照41中供试品溶液的制备方法，制得18批供试品溶液I，将上述18批供试品溶液I注入液相色谱仪中，采用57中的色谱条件，进样测定，得到18批墨旱莲药材特征图谱。参见图6。另取18批墨旱莲标准汤剂样品，按照42中标准汤剂供试品溶液的制备方法，制得18批供试品溶液II，将上述18批供试品溶液II注入液相色谱仪中，采用57中的色谱条件，进样测定，得到18批墨旱莲标准汤剂样品特征图谱。参见图7。实验结果表明，18批墨旱莲药材特征图谱具有8个特征峰，且所述8个特征峰均能从墨旱莲药材稳定转移到墨旱莲标准汤剂中，即墨旱莲药材特征图谱与标准汤剂特征图谱中的8个特征峰相对应，因此，选择此8个特征峰为墨旱莲药材的共有峰，并以峰8蟛蜞菊内酯为参照峰进行标准研究，详情参见图8、图9。8、墨旱莲药材特征图谱方法学验证1专属性考察取墨旱莲G1705159特征图谱项下供试品溶液、空白溶剂70％乙醇、参照物溶液，按已确立的色谱条件进样测定，记录色谱图图10。实验结果显示墨旱莲药材特征图谱8个色谱峰不受阴性空白溶剂的干扰，其中4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、蟛蜞菊内酯色谱峰与参照物溶液的保留时间一致，本方法具有良好的专属性。2精密度考察按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，按57中的色谱条件连续进样6次注入UPLC进行测定，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰8的相对保留时间以及相对峰面积；并计算RSD值，实验结果见表10与表11。表10墨旱莲药材特征图谱精密度考察结果相对保留时间表11墨旱莲药材特征图谱精密度考察结果相对峰面积实验结果显示，各色谱峰相对峰面积与相对保留时间RSD在0.03％～1.75％范围内，表明仪器精密度良好。3重复性考察按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，平行6份，按57中的色谱条件，进样测定，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰8的相对保留时间以及相对峰面积；并计算RSD值。结果见表12与表13。表12墨旱莲药材特征图谱重复性考察结果相对保留时间表13墨旱莲药材特征图谱重复性考察结果相对峰面积实验结果显示，重复测定6份样品，各色谱峰相对保留时间RSD在0.02％～0.19％范围内，相对峰面积RSD在0.83％～1.78％范围内，表明该特征图谱分析方法重复性良好。4稳定性考察按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，于室温下放置，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，按57中的色谱条件在0小时、2小时、6小时、12小时、18小时、24小时进样测定，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰4的相对保留时间以及相对峰面积；并计算RSD值。结果见表14与表15。表14墨旱莲药材特征图谱稳定性考察结果相对保留时间表15墨旱莲药材特征图谱稳定性考察结果相对峰面积实验结果显示，在24小时供试品溶液各色谱峰相对保留时间RSD在0.10％～0.19％，相对峰面积在0.34％～5.97％范围内，表明供试品溶液在24小时内稳定。5中间精密度考察由其他分析人员在不同日期按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，平行6份，并在不同色谱仪下操作，按57中的色谱条件，进样分析，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰8的相对保留时间以及相对峰面积；并与重复性考察数据比较，计算RSD值。结果见表16与表17。表16墨旱莲药材特征图谱中间精密度考察结果相对保留时间表17墨旱莲药材特征图谱中间精密度考察结果相对峰面积实验结果显示，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，相对保留时间RSD在0.03％～0.19％范围内，色谱峰相对峰面积RSD在0.55％～1.91％范围内，表明各色谱峰相对保留时间中间精密度较好。6耐用性考察①不同柱温考察比较不同柱温，分别是28℃、30℃、32℃对墨旱莲药材特征图谱影响。按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，按57中的色谱条件，柱温分别改为28℃、30℃、32℃，进样测定，以8号峰蟛蜞菊内酯峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积。见表18和表19。表18墨旱莲药材柱温考察结果相对保留时间表19墨旱莲药材柱温考察结果相对峰面积实验结果显示，不同柱温时，各色谱峰相对保留时间RSD在0.08％～2.36％范围内，相对峰面积RSD在0.88％～5.25％范围内，说明该方法在柱温变化幅度小时耐用性良好。②不同流速考察比较不同流速，分别是0.28mlmin、0.30mlmin、0.32mlmin对墨旱莲药材特征图谱耐用性影响。按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，按57中的色谱条件流速分别改为0.28mlmin、0.30mlmin、0.32mlmin，进样测定，以8号峰蟛蜞菊内酯峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积。结果见表20和表21。表20墨旱莲药材流速考察结果相对保留时间表21墨旱莲药材流速考察结果相对峰面积实验结果显示，不同流速时，各色谱峰相对保留时间RSD在0.2％～2.47％范围内，相对峰面积RSD在2.37％～3.35％范围内，表明该分析方法不同流速耐用性较好。③不同色谱柱考察比较AgilentSBC18色谱柱编号为025、037、040对墨旱莲药材特征图谱耐用性影响。按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，按57中的色谱条件分别用AgilentSBC18色谱柱，编号为025、037、040，进样测定，以8号峰蟛蜞菊内酯峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积。结果见表22和表23。表22墨旱莲药材特征图谱色谱柱考察结果相对保留时间表23墨旱莲药材特征图谱色谱柱考察结果相对峰面积实验结果显示，固定AgilentSBC18色谱柱时，考察不同批次的色谱柱，各色谱峰相对保留时间RSD在0.31％～3.66％范围内，除峰4外，其他峰的相对峰面积RSD在1.53％～3.32％范围内，表明该分析方法不同色谱柱耐用性较好。由于峰4受色谱柱的分离效果影响，分离度不好，故建议不宜对峰4的相对峰面积进行限定。④不同酸度缓冲液考察比较不同酸度的磷酸三乙胺缓冲液对墨旱莲药材特征图谱的影响。三种缓冲液的配制方法如下：1三乙胺磷酸缓冲液12:8[12ml三乙胺加8ml磷酸定容至1000ml，再加500ml稀释，即可。相当于以水为溶剂，含有0.53％体积分数磷酸和0.8％体积分数三乙胺]：参考中国药典2015版第四部中三乙胺缓冲液的配制方法，本缓冲液的配置方法为移取磷酸8ml、三乙胺12ml置1000ml容量瓶中，加入水定容至1000ml，摇匀，倒出置烧杯中，加入水500ml，搅拌均匀即可。后期为方便配置，改为移取5.3ml磷酸和8ml三乙胺，加入1000ml水混匀即可，即得到三乙胺磷酸缓冲液。2三乙胺磷酸缓冲液11.5:8[相当于以水为溶剂，含有0.53％体积分数磷酸和0.77％体积分数三乙胺]：取磷酸8ml、三乙胺11.5ml置1000ml容量瓶中，加入水定容至1000ml，摇匀，倒出置烧杯中，加入水500ml，搅拌均匀即可。3三乙胺磷酸缓冲液12.5:8[相当于以水为溶剂，含有0.53％体积分数磷酸和0.83％体积分数三乙胺]：取磷酸8ml、三乙胺12.5ml置1000ml容量瓶中，加入水定容至1000ml，摇匀，倒出置烧杯中，加入水500ml，搅拌均匀即可。按41中供试品溶液的制备方法制备墨旱莲G1705159的供试品溶液，精密吸取墨旱莲药材的供试品溶液，按57中的色谱条件，进样测定。以8号峰蟛蜞菊内酯为参照，计算相对保留时间与相对峰面积，实验结果见图表24、表25。表24墨旱莲药材缓冲盐考察结果相对保留时间表25墨旱莲药材缓冲盐考察结果相对峰面积实验结果显示：不同缓冲液条件下各色谱峰相对保留时间RSD在0.06％～0.66％范围内，相对峰面积RSD在1.42％～4.24％范围内，表明该方法对缓冲盐酸度的较小变动耐用性较好。综上所述，墨旱莲药材标准中规定其确定值，相对保留时间较为稳定，柱温、流速、缓冲盐比例的微小变动对墨旱莲药材特征图谱的测定结果影响较小，可在适当范围内进行调整。9、墨旱莲药材特征图谱方法的确定根据上述实验结果可确定墨旱莲药材特征图谱测定方法为：色谱条件与系统适用性试验：安捷伦ZORBAXSBC18色谱柱2.1×100mm，1.8μm；以乙腈为流动相A，以三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.53％的磷酸和体积分数为0.8％三乙胺，PH2.4为流动相B，按表5规定进行梯度洗脱；流速：0.3mlmin；柱温为30℃；检测波长：330nm。理论板数按蟛蜞菊内酯峰计算应不低于8000。参照物溶液的制备：取蟛蜞菊内酯和异绿原酸C对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含蟛蜞菊内酯8μg、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸4μg的混合溶液，即得，作为对照品参照物溶液；另取墨旱莲对照药材粉末过三号筛1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％体积分数乙醇水溶液50ml，称定重量，加热回流1h，取提取液，将所述提取液放冷，用70％体积分数乙醇水溶液补足减失的重量，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。供试品溶液的制备：取墨旱莲药材粉末过三号筛1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，称定重量，加热回流1h，将提取液放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。10、墨旱莲药材特征图谱的确定1对18批墨旱莲药材特征图谱进行分析，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰，计算8个色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，实验见结果表26、表27：表26墨旱莲药材样品测定结果相对保留时间表27墨旱莲药材样品测定结果相对峰面积结果显示，18批墨旱莲药材特征图谱具有8个共有峰，与墨旱莲标准汤剂特征图谱共有峰一致。以峰8蟛蜞菊内酯为参照峰，18批墨旱莲药材特征图谱的其余8个特征峰相对保留时间RSD值在0.14％～1.66％，均小于2.0％，符合墨旱莲药材特征图谱的标准要求；18批墨旱莲药材特征图谱的8个特征峰相对峰面积的RSD在42.19％～102.16％，结果表明不同批次墨旱莲药材的特征峰对应成分存在一定差异。结合上述相对峰面积，批次为G1710015的样品的峰1、2、4、5、6、7均与其他批次的相对峰面积相差甚远，属于离群数据，故将此批次删去再定峰面积范围；G1705160各峰的相对峰面积整体偏小，因此剔除。因此峰1～峰7相对峰面积范围依次为：0.008～0.129，0.1030～0.3472，0.0593～0.630、0.159～1.339、0.146～1.893、0.155～0.819、0.554～1.352。为严格控制墨旱莲药材的质量，为墨旱莲标准汤剂和相关制剂的制备提供质优且稳定的原料药材，对墨旱莲药材特征图谱的特征峰相对峰面积设定限量标准，是非常必要的。2特征图谱的拟定将18批墨旱莲药材特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统》匹配，生成对照图谱，建立墨旱莲药材对照特征图谱，结果如图11。对照图谱信息如下表28。表28暂定墨旱莲药材特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，与蟛蜞菊内酯参照峰相应的峰8为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为：0.13峰1、0.28峰2、0.37峰3、0.43峰4、0.73峰6、0.79峰7；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定范围为：0.008～0.129峰1、0.1030～0.3472峰2、0.0591～0.630峰3、0.159～1.339峰4、0.146～1.893峰5、0.395～0.819峰6、0.554～1.352峰7。11、墨旱莲标准汤剂色谱峰指认研究通过文献研究，采用液质联用技术，确认墨旱莲标准汤剂中可能含有的物质成分，再通过可以获得的对照品，进行指认，结果如下：指认了墨旱莲标准汤剂8个特征峰中的5个共有峰。分别为：共有峰峰1为咖啡酸；峰2为木犀草苷；峰3为异绿原酸B；峰5为异绿原酸C；峰8为蟛蜞菊内酯。实施例2墨旱莲药材的检测方法本实施例提供一种墨旱莲药材的鉴别应用，步骤如下：1色谱条件：同实施例1中的57。2参照物溶液的制备：同实施例1中的4。3待测样品溶液的制备：取待测样品过三号筛1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％体积分数乙醇水溶液50ml，称定重量，加热回流1h，取提取液，将所述提取液放冷，用70％体积分数乙醇水溶液补足减失的重量，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。4测定：精密吸取上述参照物溶液、待测样品溶液，注入液相色谱仪中，测定，得到特征图谱，如图12所示。表29待测样品特征图谱相对保留时间和相对峰面积将该待测墨旱莲药材特征图谱图12与墨旱莲药材对照特征图谱图11进行比较：数据结果显示表23，该待测墨旱莲药材能检出8个特征峰，并与对照特征图谱中的8个特征峰相对应；其相对峰面积和相对保留时间均在标准规定的范围内，由此说明，该批次墨旱莲药材质量合格，且质量较稳定，满足临床汤剂的使用要求。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种墨旱莲药材UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：参照物溶液的制备：分别以蟛蜞菊内酯和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向墨旱莲对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；供试品溶液的制备：向墨旱莲药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液I，将所述提取液I滤过，取续滤液作为供试品溶液I；向墨旱莲标准汤剂样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液II，将所述提取液II滤过，取续滤液作为供试品溶液II；测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、供试品溶液I和供试品溶液II注入超高效液相色谱仪中测定，标定水溶性共有峰，即得墨旱莲药材UPLC特征图谱。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三乙胺磷酸缓冲液，所述三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.5％-0.6％的磷酸和体积分数为0.7％-0.83％的三乙胺，梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0-3min，流动相A由体积分数为11％升高到16％，流动相B由体积分数为89％降低到84％；3min-9min，保持流动相A体积分数为16％，保持流动相B体积分数为84％；9min-20min，流动相A由体积分数为16％升高到20％，流动相B由体积分数为84％降低到80％；20min-34min，保持流动相A体积分数为20％，保持流动相B体积分数为80％；34min-40min，流动相A由体积分数为20％升高到80％，流动相B由体积分数为80％降低到20％；40min-41min，流动相A由体积分数为80％降低到11％，流动相B由体积分数为20％升高到89％；41min-50min，流动相A保持体积分数为11％，流动相B保持体积分数为89％。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：柱温28℃-32℃，流速为每分钟0.28mL-0.32mL，检测波长为254nm-360nm。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提取溶剂为体积分数为60％-80％的甲醇水溶液，用量为每1g墨旱莲药材加入50mL-100mL。5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述加热回流的时间为60min-90min。6.一种墨旱莲药材的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：参照物溶液的制备：分别以蟛蜞菊内酯和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向墨旱莲对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；待测样品溶液的制备：向待测样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液III，将所述提取液III滤过，取续滤液作为待测样品溶液；测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中测定，即可。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三乙胺磷酸缓冲液，所述三乙胺磷酸缓冲液以水为溶剂，包含体积分数为0.5％-0.6％的磷酸和体积分数为0.7％-0.83％的三乙胺，梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0-3min，流动相A由体积分数为11％升高到16％，流动相B由体积分数为89％降低到84％；3min-9min，保持流动相A体积分数为16％，保持流动相B体积分数为84％；9min-20min，流动相A由体积分数为16％升高到20％，流动相B由体积分数为84％降低到80％；20min-34min，保持流动相A体积分数为20％，保持流动相B体积分数为80％；34min-40min，流动相A由体积分数为20％升高到80％，流动相B由体积分数为80％降低到20％；40min-41min，流动相A由体积分数为80％降低到11％，流动相B由体积分数为20％升高到89％；41min-50min，流动相A保持体积分数为11％，流动相B保持体积分数为89％。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：柱温28℃-32℃，流速为每分钟0.28mL-0.32mL，检测波长为254nm-360nm。9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为体积分数为60％-80％的甲醇水溶液，用量为每1g墨旱莲药材加入50mL-100mL。10.根据权利要求6-9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述加热回流的时间为60min-90min。

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